使用磁性分离法的免疫沉淀实验步骤（用于蛋白质免疫印迹分析）

A. 溶液与试剂

注：用超纯水或相当的纯净水制备溶液。

1. 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) (#9808)
2. 1X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X Cell Lysis Buffer，将 1 ml 10X Cell Lysis Buffer 加入到 9 ml dH₂O 中，并混匀。

   注：使用前，立刻加入 1 mM PMSF (#8553)。

3. Protein A 或 G 糖珠：使用蛋白 A (#73778) 进行兔蛋白沉淀，并用蛋白 G (#70024) 进行小鼠 IgG 沉淀。
4. 3X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。
5. Magnetic Separation Rack：(#7017) 或 (#14654)

B. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。使用含有调节因子的新鲜培养基对细胞进行一段时间的处理。
2. 在非变性条件下收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 PBS 洗涤细胞一次。
3. 去除 PBS 并给每个细胞板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X Cell Lysis Buffer，并将细胞板放在冰上孵育 5 分钟。
4. 从板上刮下细胞，并且将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
5. 在冰上对样品进行 3 次超声粉碎，每次 5 秒。
6. 以 14,000 X g 的离心力在 4°C 下用微量离心机离心 10 分钟，然后将上清液转移到新试管中。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

C. 免疫沉淀法

细胞裂解物预澄清（强烈建议）

强烈建议进行细胞裂解物预澄清步骤，以减少与蛋白 A 或 G 磁珠的非特异性蛋白结合。为检测样品和同型对照预澄清足够裂解物。

1. 稍微涡旋母液试管，以重悬磁珠。

   重要事项：使用前，预洗涤 #73778 和 #70024 磁珠：

2. 转移 20 μl 珠浆到一根干净的试管中。将试管放在磁力分离架上 10-15 秒。

   一旦溶液变澄清，便小心清除缓冲液。添加 500 μl 1X Cell Lysis Buffer 到磁珠沉淀物中，稍微涡旋以洗涤微珠。将试管放回磁力分离架。一旦溶液变澄清，便清除缓冲液。再次进行洗涤步骤。

3. 添加 200 μl 细胞裂解物到 20 μl 预先洗涤的磁珠中。

   重要事项：最佳裂解物浓度将取决于目的蛋白的表达水平。建议起始浓度为 250 μg/ml - 1.0 mg/ml。

4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5. 使用一个磁力分离架将珠子与裂解物分离，并将预澄清的裂解物转移到一根干净的试管中，随后丢弃磁珠沉淀物。
6. 继续进行免疫沉淀部分。

免疫沉淀

重要事项：强烈建议使用相应的同型对照，以便在你的一抗免疫沉淀中显示特异性结合。把 Normal Rabbit IgG #2729 用于多克隆一抗，把 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP^® Isotype Control #3900 用于兔单克隆一抗，把 Mouse (G3A1) mAb IgG1 Isotype Control #5415 用于小鼠 IgG1 单克隆一抗，把 Mouse (E5Y6Q) mAb IgG2a Isotype Control #61656 用于小鼠 IgG2a 单克隆一抗，把 Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠 IgG2b 单克隆一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠 IgG3 单克隆一抗。同型对照的浓度应匹配，并与一抗样品同时进行。

1. 添加一抗（按产品数据表中建议的相应稀释度）到 200 μl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜，从而形成免疫复合物。
2. 预先洗涤磁珠（参见细胞裂解物预澄清部分，步骤 1 和 2）。
3. 将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到一根含有已洗涤磁珠沉淀物的试管中。
4. 在室温下旋转孵育 20 分钟。
5. 使用磁力分离架将磁珠沉淀。用 500 μl 的 1X Cell Lysis Buffer，洗涤沉淀物五次。洗涤间期，保持样品于冰上。
6. 在 20-40 μl 3X SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物，稍微涡旋以混匀，随后稍稍微量离心来让样品沉淀。
7. 将样品加热到 95–100°C，并持续 5 分钟。
8. 使用磁力分离架将磁珠沉淀。将上清液转移到新试管。上清液为样品。
9. 将样品 (15-35 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。
10. 用蛋白质印迹法分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验步骤：蛋白印迹实验 BSA 或蛋白印迹实验牛奶）。

注：对于分子量 50 kDa 的蛋白，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (#45262) 或 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 作为二抗，以将变性重链产生的遮盖作用减到最小。对于分子量范围约为 25 kDa 的蛋白，建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678) 或 Mouse Anti-rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (HRP Conjugate) (#5127) 来最小化变性轻链产生的干扰。