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蛋白质印迹法实验步骤

蛋白印迹实验 (WB) 广泛用于分析细胞或组织提取物中的特异性蛋白表达。在 Cell Signaling Technology (CST)，我们知晓蛋白印迹实验很耗时，而且它们的成功对您的研究进展有着重要影响。为此，我们在开发抗体时深思熟虑，提供优化的实验步骤以及参考信息和技术支持，以使您的蛋白印迹实验获得成功。

对于蛋白质印迹法，在 4°C 下，将膜在含有 5% w/v BSA 或脱脂奶粉的 1X TBS、0.1% Tween 20 中与稀释的一抗共同孵育，轻摇，过夜。

使用 Cell Signaling Technology 蛋白质印迹法实验步骤的理由

注：请参阅一抗产品网页，了解推荐的一抗稀释缓冲液和抗体稀释度。

A. 溶液与试剂

从样品制备到检测，您进行蛋白质印迹法时所需要的试剂现均包含在一个便利的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

了解我们的溶液与试剂

注：利用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。

  1. 20X 磷酸盐缓冲液 (PBS)：(#9808) 欲制备 1 L 1X PBS：添加 50 ml 20X PBS 至 950 ml dH2O，混合。
  2. 10X Tris 盐缓冲液 (TBS)：(#12498) 欲制备 1 L 1X TBS：添加 100 ml 10X TBS 至 900 ml dH2O，混合。
  3. 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过添加 1/10 体积的 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 上样缓冲液，制备新鲜的 3X 还原上样缓冲液。用 dH2O稀释至 1X。
  4. 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 配制 1 L 1X 电泳缓冲液：将100 ml 10X 电泳缓冲液加入 900 ml dH2O 中，混匀。
  5. 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(​​​#12539) 制备 1 L 1X 转移缓冲液：加 100 ml 的 10X 转移缓冲液到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混匀。
  6. 10X 含 Tween 20 的 Tris 盐缓冲液 (TBST)：(#9997) 制备 1 L 1X TBST：加 100 ml 的 10X TBST 到 900 ml 的 dH2O 中，混匀。
  7. 脱脂奶粉：(#9999)。
  8. 封闭缓冲液：含有 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；如果制备 150 ml，加 7.5 g 脱脂奶粉到 150 ml 1X TBST 中并混匀。
  9. 洗涤缓冲液：（#9997）1X TBST。
  10. Bovine Serum Albumin (BSA)：(#9998)。
  11. 一抗稀释缓冲液：含有 5% BSA 或 5% 脱脂奶粉的 1X TBST（如一抗产品网页所示）；如要制备 20 ml，往 20 ml 1X TBST 中添加 1.0 g BSA 或脱脂奶粉，并充分混匀。
  12. 生物素化的蛋白分子量标准品检测包：(#7727)。
  13. Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)：(#59329)。
  14. 印迹膜和纸：(#12369) 本操作流程已为硝酸纤维素膜优化。通常推荐孔径 0.2 µm。
  15. HRP 偶联二抗：抗兔 (#7074)；抗小鼠 (#7076)。
  16. 检测试剂：LumiGLO 化学发光试剂和过氧化物 (#7003) 或 SignalFire™ ECL Reagent (#6883)。

B. 蛋白质印迹

制备样品的常规流程。

样品制备、SDS-PAGE 和转移

  1. 使用含有调节因子的新鲜培养基对细胞进行一段时间的处理。
  2. 吸出培养基；用 1X PBS 洗涤细胞后将PBS吸出。
  3. 加入 1X SDS 样品缓冲液裂解细胞（6 孔板每孔加 100 µl 或直径为 10 cm 盘中加 500 µl）。立即从板上刮下细胞并将提取物转移至微量离心管。置于冰上。
  4. 超声裂解 10–15 秒，完成细胞裂解并剪切 DNA（以减轻样品粘度）。
  5. 加热 20 µl 样品至 95–100°C 5 分钟；在冰上冷却。
  6. 用微量离心机离心 5 分钟。

  7. 上样 20 µl 至 SDS-PAGE 凝胶 (10 cm x 10 cm)。

    注：上样预染蛋白分子量标准品（#59329，5 µl/泳道）以验证电转移，推荐用生物素化的蛋白分子量标准品（#7727，10 µl/泳道）确定分子量。

  8. 电转移至硝酸纤维素膜 (#12369)。

C. 膜封闭和抗体孵育

封闭和抗体孵育

注：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；针对不同尺寸的膜，请对体积作出相应调整。

一、膜封闭

  1. （可选）转移后，在室温用 25 ml TBS 冲洗硝酸纤维素膜 5 分钟。
  2. 室温下用 25 ml 封闭缓冲液孵育膜 1 小时。
  3. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。

二、一抗孵育

根据所用的一抗，继续后续对应的实验步骤。

对于非偶联的一抗

  1. 在 4°C 下，用 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按产品说明书中建议的适当稀释度和稀释剂配制），轻轻摇动过夜。
  2. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜与一抗匹配的 HRP-Conjugated Secondary Antibody（#7074 或 #7076，1:2000）和 Anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，1:10001–1:3000）于 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时，同时温和振荡，以检测生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

对于偶联有HRP 的一抗

  1. 在 4°C 下，用 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按产品说明书中建议的适当稀释度配制），轻轻摇动过夜。
  2. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  3. 在 10 ml 封闭液中用 Anti-biotin, HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:3000）室温孵育 1 小时，同时温和振荡，以检测生物素化蛋白标记物。
  4. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

对于生物素化的一抗

  1. 在 4°C 下，用 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育膜和一抗（按产品说明书中建议的适当稀释度配制），轻轻摇动过夜。
  2. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  3. 将膜与 Streptavidin-HRP（#3999，适宜稀释度）于 10 ml 封闭液中室温孵育 1 小时，同时温和振荡。
  4. 用 15 ml TBST 冲洗三次，每次 5 分钟。
  5. 继续进行检测（D 部分）。

请勿加入 Anti-biotin、HRP-linked Antibody 用以检测生物素化蛋白标记物。没有必要。Streptavidin-HRP 也将会使生物素化标记物可视化。

D. 蛋白质检测

蛋白质检测

  1. 用 10 ml LumiGLO（0.5 ml 20X LumiGLO #7003、0.5 ml 20X 过氧化物和 9.0 ml 纯化水）或 10 ml SignalFire™ #6883（5 ml 试剂 A，5 ml 试剂 B）孵育膜，室温条件下轻轻搅动 1 分钟。

  2. 沥干膜上多余的显影液（勿令其干燥），裹在塑料保鲜膜中，然后用 X 射线胶片曝光。初始 10 秒曝光可以指示适当的曝光时间。

    注：由于检测反应的动力学，信号在孵育后最强，后续 2 小时逐渐衰减。

2005 年 6 月发布

2016 年 6 月修订

支持：877-678-8324 [email protected] • 订购：877-616-2355 [email protected] • 网页：www.cellsignal.com