免疫沉淀法疑难排解指南

信号低/无信号

蛋白质-蛋白质相互作用遭苛刻裂解条件破坏

影响该测定结果的因素有很多，例如相关蛋白间相互作用的强度，因此研究人员通常需要调整实验条件以获得最佳结果。Cell Lysis Buffer #9803 搭配我们推荐的 IP 实验步骤，可作为开展 Co-IP 实验的适宜起始方案。
请谨记，使用上述任一种裂解缓冲液时，超声处理至关重要。它将确保充分的胞核破裂、DNA 剪切，并将导致蛋白质回收可能最大。超声处理对提取核蛋白和膜蛋白尤为重要，并且不会破坏大多数蛋白质复合体。

纳入输入裂解物对照，以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

用针对您的 IP 蛋白的抗体探测印迹物，以确保 IP 实验有效并且确保您成功沉淀出主要蛋白质。

组织或细胞系中的蛋白表达水平低

如果您的 IP 实验中未见信号，则 IP 蛋白或相互作用性目的蛋白可能可能按蛋白质印迹法检出水平以下的水平表达。

使用表达谱分析工具如 BioGPS 或 The Human Protein Atlas 以及科学文献来核查您的细胞或动物组织是否有望充分表达目的靶标蛋白。我们始终建议加入已知的阳性对照，以确认实验结果。如需了解我们许多抗体的推荐对照列表，请参阅我们按靶标列示的对照处理表。

纳入输入裂解物对照，以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

磷酸化或修饰蛋白的水平低

在细胞系或组织中，许多翻译后修饰的蛋白质按低下基础水平表达。某些靶标可能需要用化学调节剂额外处理或特定条件下生长，以便按高到足以进行蛋白质印迹检测的水平表达。

我们建议使用 PhosphoSitePlus 查找涉及您所研究特定修饰位点的低通量研究论文，或使用我们按靶标划分的对照处理表，以获取可作为阳性对照的处理方法及适配的细胞系或组织示例。

细胞提取物中包含磷酸酶抑制剂对维持蛋白磷酸化至关重要。应将焦磷酸钠（最终浓度为 2.5 mM）和 β-甘油磷酸盐（最终浓度为 1.0 mM）作为丝氨酸/苏氨酸磷酸酶抑制剂加入裂解缓冲液中。应加入正钒酸钠（最终浓度为 2.5 mM）以抑制酪氨酸磷酸酶。还可以使用 Phosphatase Inhibitor Cocktail #5870 或 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail #5872。

纳入输入裂解物对照，以确保靶标蛋白按高到足以在您的样品中检出的水平表达并且确保针对您的目的靶标的抗体一直正常工作。

表位掩蔽

表位掩蔽是指靶标 IP 蛋白上抗体的结合位点被天然条件下靶标的构象或其他相互作用性蛋白所掩盖，从而导致阴性 IP 结果。

如果怀疑存在表位掩蔽，最好尝试一种识别靶标蛋白不同区域内表位的抗体。可以在抗体产品页面的“来源/纯化”部分下找到关于 CST 抗体的表位区域信息。
 

IgG 与珠子的结合作用低

根据正用于 IP 的抗体的宿主物种优化珠子选择。组合蛋白 A/G 珠也可能有助于增加 IgG 结合。
 

多个条带或非特异性结合

脱靶蛋白质与珠或 IgG 对照非特异性结合

单一珠对照充当额外的阴性对照，以考虑 IP 实验内部任何非特异性蛋白质-珠相互作用。如果单一珠对照实验中观察到背景，则可能需要预先清理裂解物。在 IP 实验之前，通过将裂解物与珠子单独在 4°C 孵育 30-60 分钟进行预清除。

也可纳入同型对照，以显示背景是否由蛋白质非特异性结合于 IP 抗体的 IgG 导致。

同工型反应性或翻译后修饰

某些细胞系和组织模型可以包含多种蛋白同工型或剪接变体，它们可以不同的分子量迁移。

翻译后修饰 (PTM) 会导致部分靶蛋白的电泳速率与未修饰蛋白不同。糖基化、SUMO 化、泛素化和磷酸化便是修饰的例子，这些修饰可能导致蛋白印迹上出现多个条带，但具体取决于使用的样品和处理方法。

纳入输入裂解物对照，以确定额外条带是否由结合于抗体引起。请参阅抗体网页上的“特异度/灵敏度”部分，确定是否预测或确认可检测到多种同工型。还可以在 UniProt 上查阅目的蛋白，看看是否列出了多个同工型序列。

如果您正在查找更多靶蛋白相关的 PTM 信息，请参阅 PhosphoSitePlus。

如果输入对照中未观察到背景，则来源可能归因于蛋白质与珠或 IgG 的非特异性结合。在这种情况下，将需要单一珠对照或同型对照来确定额外条带的原因（参见以上部分）。

靶标信号遭 IgG 掩蔽

靶标信号遭重链或轻链 IgG 掩盖

在进行 IP 实验并后续开展蛋白质印迹法检测时，IP 实验中所用一抗的变性 IgG 轻链和重链，在蛋白质印迹膜上的迁移位置分别对应约 25 和 50 kD；这些条带常可能掩盖与之分子量相近的靶标蛋白条带。来自同一宿主动物的抗体既用于 IP 又用于蛋白质印迹法是导致此结果的原因。蛋白质印迹法中所用的二抗不仅检出用于一抗孵育的天然 IgG，还检出用于 IP 的抗体的变性重链与轻链。

有几种方法避免这种后果：

来自不同物种的抗体用于 IP 和蛋白质印迹法。例如，兔抗体用于 IP 而小鼠抗体用于蛋白质印迹法，或反之亦然。请注意，二抗需有物种特异性。我们的检测使用了Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody #7074 和 Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody #7076，这两种抗体分别对兔源 IgG 和鼠源 IgG 具有高特异性。我们未随这些二抗观察到物种交叉反应性。

来自相同物种的生物素化一抗用于蛋白质印迹法。然后可以使用不会与变性 IgG 交叉反应的 Streptavidin-HRP #3999 检测生物素化抗体。

如果您的靶标在 25 kDa 附近没有迁移，则可以使用轻链特异性二抗。CST 提供 Mouse Anti-Rabbit IgG (Light-Chain Specific) (D4W3E) mAb (HRP Conjugate) #93702 和 Rabbit Anti-Mouse IgG (Light Chain Specific) (D3V2A) mAb (HRP Conjugate) #58802。

使用优先结合天然 IgG 的我司 Protein A (HRP Conjugate) #12291 替换蛋白质印迹法检测中的二抗。但是，需要注意，#12291 可能与高浓度的变性 IgG 交叉反应。

构象特异性二抗用于蛋白质印迹法。CST 提供优先结合天然构象下 IgG 的 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb #5127。但是，需要注意的是，#5127 也可能与高浓度的变性 IgG 交叉反应。