免疫荧光 (IF) 疑难排解指南
信号微弱或没有信号 |
|
可能原因 |
建议 |
|
样品保存不当；如果荧光团暴露于光线下的时间过长，可能会导致信号衰减。 |
在避光条件下进行孵育和保存样本。可在防淬灭溶液中封固样品，比如 ProLong® Gold Antifade Reagent #9071。为了获取最佳结果，样本封固后要立即采集图像。 |
|
细胞/组织样品保存期过长 |
使用新制备的载玻片/平板，以避免丧失抗原。 |
|
固定不充分 |
请查阅 CST 产品说明书中建议的操作步骤；处理后立即移除介质并在固定剂中快速/彻底清洗。对于磷酸化特异性的抗体，使用浓度至少 4% 的甲醛来抑制内源性磷酸酶。 |
|
不正确抗体稀释比例（抗体过度稀释） |
请查阅 CST 产品说明书或访问 cellsignal.com 了解建议的抗体稀释度。 |
|
未使用建议的孵育时长 |
根据经严格检测的操作步骤进行一抗孵育，才能获得一致、可靠的结果。经开发和验证的 CST 抗体在 4°C 下过夜孵育时可获得最佳结果。 |
|
不恰当的检测系统 |
在可能得情况下，应通过蛋白印迹法或其它方式来确认蛋白表达。 |
|
未正确地诱导靶标蛋白 |
应针对每种靶标确定各自的最佳处理条件和对照。 |
|
目标蛋白表达量较低 |
修改检测方法；考虑放大信号，或与更亮的荧光团配对。 |
|
错误的通透化方法 |
请查阅产品说明书中建议的操作步骤。 |
|
二抗使用不当 |
按建议的浓度使用并检查二抗是否与一抗的宿主物种相匹配。 |
|
错误的激发波长 |
确保激发和检测（激光/激发/发射滤光器）与荧光基团激发光波长相匹配。 |
|
多重 IHC 中信号弱 |
优化脱蜡、抗原修复和信号放大方法。 |
高背景 |
|
可能原因 |
建议 |
|
样品自发荧光 |
以未染色的样本作为对照，检测自发荧光程度。请查看说明书中适用的固定试剂。用久了的固定剂可能会出现自发荧光；更换陈旧甲醛母液并制备新鲜的稀释液。使用在安瓿中新稀释，可用于EM 级电子显微镜的戊二醛。为低丰度靶标选择波长较长的波长通道。 |
|
封闭不充分 |
使用与二抗相同物种的正常血清。根据本底来源，考虑使用基于电荷的封闭剂，比如 Image-iT® FX Signal Enhancer #11932。 |
|
不正确的抗体稀释度（一抗或二抗浓度过高） |
请查阅 CST 产品说明书或访问 cellsignal.com 了解建议的抗体稀释度。 |
|
样本变干 |
在整个染色过程中，确保样本始终浸没在液体中至关重要。 |
|
清洗不充分 |
清洗以去除多余固定剂、多余二抗，以及结合松散的非特异性的抗体相互作用。 |
|
二抗交叉反应 |
使用同型对照抗体确定您的二抗是否发生交叉反应。 |
|
非特异性抗体结合 |
有可能的话，请与敲低（siRNA) 或敲除细胞比较，或与已知靶抗原表达水平较高或较低的细胞进行比较。 |