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CUT&RUN 解惑答疑指南

A：测试细胞对洋地黄皂苷的敏感性

在 CUT&RUN 试剂盒实验步骤中，向缓冲液中添加洋地黄皂苷能促进细胞膜透化以及一抗和 pAG-MNase 酶进入细胞和胞核。因此，缓冲液中有足量的洋地黄皂苷对抗体和酶的成功结合以及靶向基因位点的消化至关重要。不同细胞系对洋地黄皂苷细胞透化有不同的敏感性。虽然本实验步骤中建议的洋地黄皂苷量应足以对大多数细胞系或组织进行透化，但您可以使用本实验步骤测试您的特定细胞系或组织。我们发现，添加过量的洋地黄皂苷对本实验没有损害，因此无需生成浓度曲线。所以，进行快速测试以确定建议的洋地黄皂苷量是否适合你的细胞系就足够了。

在开始之前：

  • 取出 Digitonin Solution #16359，并在 90-100°C 下加热 5 分钟。确保完全解冻为溶液。立即将已融化的 Digitonin Solution #16359 放在冰上。

    注：Digitonin Solution #16359 应储存于 -20°C。请在使用过程中将其保存在冰上，并在当日实验完成后保存在 -20°C 下。

  • 对于每个细胞或组织样品，准备 100 µl 洗涤缓冲液（10 µl 10X Wash Buffer #31415 + 90 µl Nuclease-free Water #12931）。此测试无需添加亚精胺或蛋白酶抑制剂。
  1. 用一个 1.5 ml 试管收集 10,000-100,000 个细胞。对于组织，从 1 mg 组织中收集分解的细胞（第 I-C 部分步骤 1-13）。如果您在 CUT&RUN 实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。
  2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
    注：如果肉眼看不到细胞沉淀物，我们建议在步骤 2 中对细胞悬液进行初次离心后，在不扰动细胞沉淀物的前提下，尽可能多地移除细胞培养基，每反应体系保留少量细胞培养基即可。然后在步骤 3 中，向细胞悬液中加入足够的 1X 洗涤缓冲液，使总体积达到 100 µl。
  3. 在 100 µl 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
  4. 将 2.5 µl Digitonin Solution #16359 添加到每次反应中，并在室温下孵育 10 分钟。
  5. 将 10 µl 细胞悬液与 10 µl 0.4% 台盼蓝染料混合。
  6. 使用血细胞计数器或细胞计数器计算染色细胞的数量和细胞总数。充分通透导致 >90% 的细胞着染台盼蓝。
  7. 如果被台盼蓝染色的细胞不到 90%，则增加洋地黄皂苷缓冲液中添加的 Digitonin Solution #16359 的量，并重复步骤 1-5，直到 >90% 的细胞被通透和染色。在第 I-IV 部分中采用上述 Digitonin Solution #16359 的量。

B：对输入样品进行超声处理优化

建议对 DNA 输入样品进行超声处理，因为 DNA 纯化离心柱只能纯化片段化的基因组 DNA (<10 kb)。此外，片段化的基因组 DNA (<1 kb) 可在 NG-seq 分析中用作阴性对照。应优化超声处理步骤，以使 DNA 输入的长度为 100-600 bp。

我们建议使用input样品进行 NG-seq，因为它能方便且无偏倚的呈现细胞基因组。虽然 IgG 样品也可在 NG-seq 中用作阴性对照，但由于存在非特异性结合，它可能会显示基因组特定区域出现富集。非片段化input DNA 可用于 qPCR 分析。但必须使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化非片段化的 DNA。

在开始之前：

! 所有缓冲液的体积都应根据正在制备的输入样品的数量按比例增加。

  • 取出 DNA Extraction Buffer #42015 并置于室温下复温，确保其完全融化成溶液。
  • 每份输入样品制备 2.1 ml 1X 洗涤缓冲液（210 µl 10X Wash Buffer #31415 + 1.89 ml Nuclease-free Water #12931），并让其平衡到室温，以最大程度地减少细胞应激。无需向此洗涤缓冲液添加亚精胺或 Protease Inhibitor Cocktail #7012。
  • 每份输入样品制备 2 µl Proteinase K #10012 + 0.5 µl RNAse A #7013，添加到 197.5 µl DNA Extraction Buffer #42015（每份输入样品 200 µl）中。
  1. 在 1.5 ml 试管中，收集与您在 CUT&RUN 实验中用于输入的相同数量的细胞（5,000 到 100,000 个细胞），用于测试的每个超声处理条件。对于组织，从用于 CUT&RUN 实验（第 I-C 部分步骤 1-13）输入的相同数量的组织中收集分离的细胞，用于测试的每个超声处理条件。如果您在实验中使用固定的细胞或组织，请确保以与此测试相同的方式固定细胞或组织。
  2. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
    注：如果在处理低细胞数（<100,000 个细胞）时肉眼看不到离心后的细胞沉淀物，我们建议跳过下面的洗涤步骤 3-5。在步骤 2 中对细胞悬液进行初次离心后，在不扰动细胞沉淀物的前提下，尽可能多地移除细胞培养基，每反应体系保留少量细胞培养基即可。然后在步骤 6 中，将足够的 1X 洗涤缓冲液（+ 亚精胺 + PIC）添加到细胞悬液中，以便在每个被测试的超声处理条件下达到 100 µl 的体积。
  3. 轻轻上下吹打，以在 1 ml 1X 洗涤缓冲液中重悬细胞沉淀物。
  4. 在室温下以 600 x g 离心分离 3 分钟，然后移除液体。
  5. 重复步骤 3 和 4 一次来再次清洗细胞沉淀物。
  6. 对于每个被测试的超声处理条件，加入 100 µl 的 1X 洗涤缓冲液，并通过轻轻上下吹打重悬细胞沉淀物。
  7. 对于每个超声处理的条件，分装 100 µl 细胞悬液到一个新试管中。
    注：步骤 9 中在 55 °C 下孵育样品，因此建议使用一个可封盖的 1.5 ml 试管，以减少孵育过程中出现蒸发。
  8. 向每份样品添加 200 µl DNA 提取缓冲液（+ 蛋白酶 K + RNAse A），并使用移液管上下吹打混合。
  9. 将试管放在 55°C 下 1 小时，保持摇晃混匀试管。
  10. 将试管放在冰上 5 分钟，让样品完全冷却。
  11. 通过设置时间梯度实验（采用 15 秒脉冲超声循环，且循环次数逐步增加），为您的超声波破碎仪确定最优超声条件。确保在两次脉冲之间将样品放在冰上孵育 30 秒。
  12. 在 4°C 的微量离心机中以 18,500 x g 离心 10 分钟，以澄清裂解物。将上清液转移至一个新的 2 ml 微量离心管中。
  13. 按照第 VI 部分的说明，使用 DNA 纯化离心柱或使用苯酚/氯仿提取后再行乙醇沉淀方法来纯化 DNA 样品。
  14. 从离心柱中洗脱 DNA，或在 30 µl 1X TE 缓冲液或 Nuclease-free Water #12931 中重悬 DNA 沉淀物。
  15. 通过电泳确定 DNA 片段大小。将 >15 µl 样品上样到含 100 bp DNA 标准品的 1% 琼脂糖凝胶上。建议使用无染料上样缓冲液（30% 甘油）以便更好地观察凝胶上的 DNA 拖尾。
  16. 选择能产生最佳 DNA 片段大小 (100-600 bp) 的超声处理条件，并用于第 IV 部分步骤 4 中的输入样品制备。如果未达到最佳声处理条件，则增加或减少超声波仪的功率设置或声处理周期数，并重复声处理时程实验。

C：疑难排解指南

问题 可能的原因 建议
问题 可能的原因 建议
1. 在实验期间，Concanavalin A 珠子会结块。 珠子结块是正常的，并且通常不会影响检测。 轻轻上下吹打来重悬结块的珠子。摇动而不是旋转样品管可能有助于珠子在管壁上结块和干燥。
室温孵育珠子和细胞的时间过长。 在 4°C 下激活刀豆蛋白 A 珠子，随后与细胞共同孵育，孵育时长不超过 5 分钟（第 II 部分步骤 7）。
细胞在制备期间裂解。 确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激（第 I 部分）。
洋地黄皂苷浓度可能太高。 一些细胞可能对洋地黄皂苷更敏感，且在更高浓度下裂解。减少检测中的洋地黄皂苷量，但要确认使用的量足以进行细胞透化（见附录 A）。
2. 使用基于 picogreen 的 DNA 定量测定法时，在纯化的 DNA 样品中未检测到 DNA。 这通常发生在使用起始数量极少的细胞时（≤20,000 个细胞），但当使用建议的 100,000 个起始细胞时应能检测到 DNA。 确保使用基于picogreen 的 DNA 定量测定法。由于起始数量较少，使用 NanoDrop、Bioanalyzer® 或 Tapestation® 通常无法检测到纯化的 DNA。
在制备期间，会发生细胞计数下降、细胞丢失或裂解。 起始细胞培养应为 60%-90% 融合度且看起来健康 (>90% 活细胞）。确保使用自动细胞计数器或血细胞计数器获得准确的细胞计数。
确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激。
清洗试管中的所有细胞，以最大程度地减少细胞丢失（第 I 部分）。
细胞过度固定。 选择固定细胞时，强烈建议轻度固定（0.1% 甲醛，2 分钟）。对于一些棘手的组织类型（纤维组织），如果轻度固定未观察到最佳结果，则可以使用中度固定条件（0.1% 甲醛，10 分钟）进行处理。
使用的细胞过少。 每次反应尽可能使用 100,000 个细胞。对于组蛋白修饰，至少需要 5,000 个细胞。对于转录因子和辅因子，至少需要 10,000 个细胞。
太多的培养基参与了伴刀豆球蛋白 A 珠结合的反应。 当反应中超过 40% 的培养基时，刀豆蛋白 A 珠子与细胞的结合大大减少，细胞可能会丢失。离心细胞悬液以去除培养基，使每反应剩余体积少于 40 µl。然后将 1X 洗涤缓冲液添加到总共 100 µl 反应中，以获得最佳的刀豆球蛋白 A 珠子结合效果。
组织样本没有完全分解。 将组织样本分解成单细胞悬液，直到观察不到组织块。对于难以完全解聚的纤维组织类型，增加组织的起始量以补偿组织解聚过程中的细胞损失。
洋地黄皂苷不能有效使细胞通透。 不使用时，请务必将 Digitonin Solution #16359 储存在 -20°C 下，因为储存在 -20°C 以上时稳定性较差。
确保测试并确认使用的洋地黄皂苷量足以通透您的特定细胞系（见附录 A）。
pAG-MNase 酶在检测中无法正常工作。 pAG-MNase 高度稳定，在 20°C 下储存时应能长时间保持活性。
pAG-MNase 需要 Ca2+ 二价阳离子才能激活。确保添加氯化钙来激活酶（第 IV 部分步骤 8）。
确保消化 30 分钟，以使酶能充分消化染色质（第 IV 部分步骤 9）。
抗体在 CUT&RUN 测定中不起作用。 并非所有抗体都可应用于 CUT&RUN。如可能，使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。或者，一些经 ChIP 和 IF 验证的抗体也可用于 CUT&RUN。
确保包含阳性对照 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751，以证实您的检测是有效的。
3. qPCR 或 NG-seq 分析中没有信号。 查看问题 2 中的所有可能原因。 查看问题 2 的所有建议。
消化温度可能太低。 我们发现，在冰上 (0°C) 进行消化可显著降低靶标染色质片段的回收率，从而导致 qPCR 和 NG-seq 信号降低。请确保在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。
PCR 扩增区域可能横跨无核小体的区域。 CUT&RUN 测定中生成的 DNA 片段通常比 ChIP 实验中生成的 DNA 片段小。因此，设计引物来生成不长于 60-80 bp 的扩增子至关重要。
qPCR 反应中未添加足量的 DNA。 在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。
NG-seq DNA 库制备中未添加足量的 DNA。 使用尽可能多的起始 DNA，最多使用 20 个 PCR 扩增循环。
由于 DNA 起始量较低，因此需要对标准 NGS 库制备实验步骤进行修改。 请务必遵循 CUT&RUN DNA 库制备的建议，这与 ChIP DNA 库制备的建议不同（参见 CUT&RUN Assay Kit #86652 第 VIII 部分）。
4. qPCR 或 NG-seq 分析中的背景信号高。 样品处理过度，基因组 DNA 已经被高度碎裂。 始终使用 Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (CUT&RUN) #66362 阴性对照抗体来确定 CUT&RUN 测定中的背景信号。
为最大限度地减少 DNA 碎裂，避免在细胞再悬浮期间剧烈涡旋和产生气泡。
由于细胞应激和裂解，基因组 DNA 已被高度碎裂。 确保在室温下尽快制备细胞，以最大程度地减少细胞应激（第 I 部分）。
消化温度可能太高。 应在 4°C 的控温板上或在冰箱中进行消化。在较高温度下消化会显著增强背景信号。
在开始消化之前，确保预冷样品并将氯化钙放在冰上。
非特异性基因组 DNA 大片段还会扩散到上清液中，并且污染由靶向酶解剪切产生的较小片段。 请勿在 37°C 下孵育样品 >10 分钟，也不要在孵育期间摇晃样品（第 IV 部分步骤 11）。十分钟足以使被消化的片段扩散到上清液中。
在 qPCR 分析前，使用 AMPure® XP Beads 或 SPRIselect® Reagent Kit 选择大小可以去除基因组 DNA 大片段。
对于 NG-seq 分析，在文库构建期间缩短 PCR 扩增时间（10-15 秒），即可排除 DNA 大片段扩增。
检测中使用过多抗体，导致非特异性结合和消化。 如可能，确保按推荐的稀释比例使用一种经 CUT&RUN 验证的抗体。如果没有，经 ChIP 验证和经 IF 验证的抗体在建议的 ChIP 和 IF 稀释度下通常有效。您可能需要在检测中通过滴定实验确定抗体用量。

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