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染色质免疫沉淀法实验步骤疑难排解指南

A. 预期的染色质产率

当从组织样品获取交联的染色质时，染色质的产率可因组织类型不同而产生显著差异。下表提供了根据操作流程第四部分测定，来自 25mg 组织或 4 x 106 HeLa 细胞的染色质预期总产率，以及预期 DNA 浓度。

  • 在 SimpleChIP® Enzymatic 实验步骤中，使用 BD Medimachine 系统 (BD Biosciences) 或 Dounce 匀浆器进行分离而产生的染色质数量相似。但相比使用 Dounce 匀浆器，使用 Mediamachine 系统通常可以获得更高的 IP 效率。强烈推荐 Dounce 匀浆器用于脑组织的解离，因为 Medimachine 系统不能将脑组织充分解离为单个悬浮细胞。
  • 在 SimpleChIP® Sonication 实验步骤中，建议对所有组织类型使用 Dounce 匀浆器。

为了获得最佳 ChIP 结果，我们推荐每次 IP 使用 5 至 10 μg 的经交联后处理的染色质片段，某些组织每次 IP 可能需要 25 mg 以上。

SimpleChIP® Kit 酶处理 超声处理
组织 / 细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度 染色质总产率 预期 DNA 浓度
组织 / 细胞 染色质总产率 预期 DNA 浓度 染色质总产率 预期 DNA 浓度
脾 每 25 mg 组织 20–30 µg 200–300 µg/ml NT NT
肝 每 25 mg 组织 10–15 µg 100–150 µg/ml 每 25 mg 组织 10–15 µg 100–150 µg/ml
肾 每 25 mg 组织 8–10 µg 80–100 µg/ml NT NT
脑 每 25 mg 组织 2–5 µg 20–50 µg/ml 每 25 mg 组织 2–5 µg
25 mg 组织		 20–50 µg/ml
心脏 每 25 mg 组织 2–5 µg 20–50 µg/ml 每 25 mg 组织 1.5–2.5 µg 15-25 µg/ml
Hela 每 4 x 106 个细胞 10–15 µg 100–150 µg/ml 每 4 x 106 个细胞 10–15 µg 100–150 µg/ml

NT = 未检测

B. 染色质碎裂优化

在 SimpleChIP® 酶解法操作流程中，150–900 bp 大小的片段为交联染色质 DNA 消化的最佳程度，关键在于消化过程中所使用的微球菌核酸酶与组织的量或细胞数量的比例。以下是用于测定特定组织或细胞类型的最佳消化条件的操作流程。

  1. 按照操作流程第 I、第 II 和第 III 部分中所述，从 125 mg 组织或 2 x 107 个细胞（等同于 5 份 IP 样品）制备交联的染色质。在操作流程第 III 部分的步骤 2 之后停止，并如下所述继续。
  2. 将 100μl 胞核样品转移到 5 个单独的 1.5 ml 离心管并置于冰上。
  3. 将3μl微球菌核酸酶添加至27μl的1X缓冲液 B+ DTT（1:10 稀释比例的酶）。
  4. 在步骤2的5个离心管的每一个中添加0 μl、2.5 μl、5 μl、7.5 μl和10 μl的稀释的微球菌核酸酶，将离心管颠倒若干次进行混合，并在37°C下孵育20分钟，同时频繁混合。
  5. 添加 10μl 0.5 M EDTA 并将离心管置于冰上来停止消化。
  6. 4°C 下，在微量离心机中以 13,000 rpm 转速离心 1 分钟将细胞核沉淀，然后去除上清液。
  7. 在 200 μl 的 1X ChIP buffer + PIC 中重悬胞核沉淀。在冰上孵育10分钟。
  8. 用几次超声脉冲对裂解产物进行超声处理来碎裂核膜。脉冲之间在冰上孵育样品 30 秒。在光学显微镜上观测超声处理前后的细胞核，确定细胞核完全裂解所需的最佳条件。使用设置为 6 且配有 1/8 英寸探头的 VirTis Virsonic 100 超声匀浆器/超声仪在 3 组 20 秒脉冲之后，HeLa 细胞核完全裂解 。或者，在 Dounce 匀浆器中对裂解产物匀浆 20 次裂解细胞核，但裂解可能不完全。
  9. 在4°C下，在微量离心机中以10,000 rpm的转速离心10分钟使裂解产物澄清。
  10. 将 50μl 每份超声处理的裂解产物转移至新的微量离心管。
  11. 在每份50μl的样本中，加入100μl不含核酸酶的水、6μl的 5M NaCl 和2 μl RNAse A.涡旋进行混合并在37°C下孵育30分钟。
  12. 在每份 RNA 酶 A 消化的样品中加入 2μl 蛋白酶 K。涡旋混合并在 65°C 下孵育样品 2 小时。
  13. 取出 20μl 的每份样本并通过用 100bp 的 DNA 标记物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳来测定DNA片段大小。
  14. 测试哪种消化条件产生的 DNA 在 150 - 900 bp大小（1 至 6 个核小体）范围内。使用这个优化的操作流程产生满意的 DNA 片段大小的稀释微球菌核酸酶的体积等于应被添加到一次 IP 制备样品（25 mg 解离组织细胞或 4 x 106 个组织培养细胞） 中酶储存原液的 10 倍。例如，在此操作流程中，如果 5μl 的稀释微球菌核酸酶产生 150 至 900bp 的 DNA 片段，那么在第 III 部分染色质的消化期间，一份 IP 样品中应添加 0.5μl 的微球菌核酸酶原液。
  15. 如果结果表明 DNA 不在所需范围内，则重复优化操作流程，相应地调整每次消化中微球菌核酸酶的用量。或者，可以改变消化时间以提高或降低 DNA 片段化的程度。

在 SimpleChIP® 超声处理操作流程中，交联染色质 DNA 片段化的最佳条件，主要取决于所使用的细胞数量、样品体积、超声处理时长和超声仪功率设置。对于每份超声处理的样品，我们建议每 1 ml ChIP Sonication Nuclear Lysis Buffer 使用 100 至 150 mg 组织或 1×10^7 至 2×10^7 个细胞。以下是确定某种特定组织或细胞类型的最佳超声处理条件的实验步骤。在 200 μl 1X ChIP 缓冲液 + PIC 中重悬胞核沉淀物。在冰上孵育10分钟。

  1. 按照第 I、第 II 和第 III 部分中所述，从 100 至 150 mg 组织或 1×10^7 至 2×10^7 个细胞中制备交联的胞核。在第三部分的步骤 4 之后停止，并按如下所述继续。
  2. 通过超声处理使染色质片段化 可以在给定功率设定下，通过调整超声处理轮次和持续时间，确定给定超声仪的最佳超声处理条件：（请参见第 III 部分的步骤 5，了解使用 Branson Digital Sonifier 250 探针超声仪的最佳功率设定）。为了确定最佳超声处理条件，对超声处理时间以及间隔进行优化，并在给定轮次或持续时间的超声处理后，取出 50 µl 染色质样品。例如，每次超声处理 1 至 2 分钟后取出染色质样品。
  3. 在 4°C 下用微量离心机以 21,000 x g 的离心力离心 10 分钟，让染色质样品变澄清。
  4. 将上清液转移到新的离心管，添加 100μl 无核酸酶的水、 6 μl 5 M NaCl #7010 和 2 μl RNA酶 A #7013。涡旋混合，并在 37℃ 下孵育样品 30 分钟。
  5. 在每份经 RNA 酶 A 消化的样品中，添加 2 μl 蛋白酶 K #。涡旋混合并在 65℃ 下孵育样品 2 小时。
  6. 取出 20μl 的每份样本并通过用 100bp 的 DNA 标记物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳来测定DNA片段大小。
  7. 选择产生最佳 DNA 片段大小的超声处理条件（请参见下文注释），并用于第 III 部分步骤 5 中的染色质制备。如果未达到最佳超声处理条件，可以增加或减少超声仪功率设定，然后重复对超声时间以及间隔进行优化。

注：使用不同样品类型和固定时间时，最佳超声处理条件也不同。使用满足所需长度的染色质片段大小要求的最小超声处理次数即可。超声处理过度会表现为 >80% 总 DNA 片段短于 500 bp，可能导致过度损坏染色质和较低的免疫沉淀效率。

  • 对固定 10 分钟的细胞进行超声处理时，最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾，DNA 总片段中有约 90% 短于 1 kb。延长固定时间至 30 分钟会减少碎裂，从而产生 DNA 拖尾，其中含有约 60% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。
  • 对固定 10 分钟的组织进行超声处理时，最佳超声处理条件会产生 DNA 拖尾，DNA 总片段中有约 60% 短于 1 kb。延长固定时间至 30 分钟会减少碎裂，从而产生 DNA 拖尾，其中含有约 30% 短于 1 kb 的 DNA 总片段。

C. 疑难排解表

问题可能的原因建议
问题可能的原因建议
1. 染色质片段的浓度过低。染色质制备时所用的细胞或组织不足，或细胞/组织裂解不充分。如果染色质制备样品的 DNA 浓度接近于 50 μg/ml，则每个 IP 样品中需额外添加染色质，以达到至少 5 μg/IP 的水平，然后继续进行后续实验步骤。
交联前，对单独平板上的细胞进行计数，以确定准确的细胞数量。
酶处理：在超声处理前后，在显微镜下观察细胞核以确认细胞核完全裂解。
2. 染色质片段化不足或片段过大。染色质片段较大会导致背景增强和分辨率降低。细胞可能过度交联和/或处理了过多的输入材料（细胞/组织）。将交联时间缩短在 10 至 30 分钟范围内和/或减少每次超声处理所用的细胞/组织数量。
酶处理：向染色质消化物增加微球菌核酸酶的量或针对酶消化条件进行预实验。
超声处理： 进行超声处理时间梯度摸索。
3. 染色质片段化过度。在PCR 定量期间，将染色质消化成单核小体长度的 DNA 可能会减弱信号，尤其是长度大于 150bp 的扩增子。染色质过度超声处理可能会破坏染色质的完整性，并使抗体表位变性。酶法：添加用于消化的细胞不够或 micrococcal nuclease 过多。酶处理：交联前，对组织称重或对一皿细胞计数，以测定准确的细胞数。在染色质消化中添加更多的组织或细胞或更少的微球菌核酸酶。
超声处理：条件过于苛刻。超声处理：对超声时间以及间隔进行优化，以找出可实现适当超声处理的最少输出/持续时间。
4. 样品输入对照组 PCR 反应中无产物或产物很少。添加至 PCR 反应的 DNA 不足或条件不是最佳。在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。使用来自交联和片段化染色质的纯化 DNA ，优化实验引物组的 PCR 条件。
PCR 扩增区域可能跨越无核小体的区域。设计另外的引物，并将扩增片段的长度减少至 150 bp。
添加用于免疫沉淀的染色质不足，或染色质被过度碎裂。为获得最佳 ChIP 结果，每次 IP 添加 5–10 μg 染色质。参见上述问题 1 和 3 的建议。
5. 阳性对照组蛋白 H3-IP RPL30 PCR 反应中无产物。添加至 IP 反应的染色质或抗体不足，或者 IP 孵育时间过短。确保在每个 IP 反应中添加 5–10 μg 染色质和 10 μl 抗体，并与抗体孵育过夜，然后添加蛋白 G 珠子之后再孵育 2 小时。
Protein G 微珠中的染色质未完全洗脱。将染色质从蛋白 G 珠子上洗脱的最佳条件为 65°C，同时频繁混合以保持珠子悬浮在溶液中。
6. 阴性对照 Rabbit IgG-IP 和阳性对照 Histone H3-IP PCR 反应中产物的数量相等。添加至 IP 反应的染色质过多或不足。或者， IP 反应添加的抗体过多。在每个 IP 反应中添加不超过 15 μg 染色质和 10 μl 组蛋白 H3 抗体。将 Normal Rabbit IgG 用量缩减至 1 μl/IP。
添加至 PCR 反应的 DNA 过多或扩增循环次数过多。在 PCR 反应中添加更少的 DNA 或减少 PCR 循环数。要进行精确定量，在 PCR 的线性放大阶段分析 PCR 产物非常关键。
7. 实验抗体 IP PCR 反应中无产物。PCR 反应中添加的 DNA 不足。在 PCR 反应中添加更多 DNA 或增加扩增循环次数。
IP 反应中添加的抗体不足。通常，在 IP 反应中添加 1–5 μg 范围内的抗体；但是具体用量很大程度取决于所使用的抗体。增加 IP 中添加的抗体用量。
抗体不适用于 IP。选择其他经 ChIP 验证的抗体。

2008 年 3 月发布

修订于 2017 年 5 月

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