SignalStar™ 二抗试剂盒可在 SignalStar™ 多重免疫组织化学实验中手动使用

在设置实验之前，请完整阅读溶液制备和实验步骤。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。对于每个荧光信道，成像轮次可以含有仅 1种互补性寡核苷酸。切勿在相同成像轮次合并专属于相同荧光信道的互补性寡核苷酸，因为这会使分析结果不可解读。

切勿合并来自不同检验组合的抗体。如果您同时运行多个检验组合，则必须为每个检验组合生成单独的抗体/互补性寡核苷酸混合物。

一些 SIGNALSTAR 试剂盒组分具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

请确认您的 SignalStar 检验组合设计是否要求 2 轮成像。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

载玻片应在完成染色的 8 小时以内成像。如果载玻片未在这个时间段以内成像，则荧光信号可能减弱。

确认您的显微镜可以检出此试剂盒提供的荧光团。成像时，除 DAPI 外，还存在 4 个需要采集的荧光信道。请联系您的仪器供应商以确认仪器设置。

建议应通过将单张染色的载玻片对上述光谱成像，创建光谱库。这可以实现更好的通道分离，以帮助最大限度降低光谱交叉干扰的可能性。

建议使用 DAPI 浓缩物，而不是含 DAPI 的封固剂。DAPI 亮染便利更好地对齐图像。

如果没有严格遵循本实验步骤，可能无法保证实验结果。SignalStar 实验步骤用指定的抗原修复步骤和染色步骤开发并优化。

建议使用阳性对照载玻片。每次运行中应纳入一个参照组织，该组织已经用显色染色确认包含多重检验组合中的所有靶标。

组织制备和固定方法可能有所不同，因此提供足够的抗体试剂以供在 1:50 至 1:200 稀释范围内使用。建议以 1:100 的比例使用每种抗体进行初步测试，以确定是否需要滴定。

在整个染色过程中，尽可能沥干孵育液和 dH₂O，同时不允许载玻片干透。在每个步骤之后，从每张载玻片彻底拂去液体，然后继续下一个步骤。

以下 SignalStar 试剂盒组分可在使用前于 4℃ 下解冻过夜：

• SignalStar™ Antibody Diluent A
• SignalStar™ Antibody Diluent B
• SignalStar™ Amplification Buffer A
• SignalStar™ Amplification Buffer B
• SignalStar™ Ligation Buffer

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。在制作溶液之前，请完整阅读第 5 节的 SignalStar 第 1 轮成像：使用的实验步骤。

除非另有说明，SignalStar 试剂盒组分应在使用前立即于室温下解冻，然后在使用时存放在冰上。

该试剂盒不包含一抗稀释剂和一抗。请按照制造商提供的推荐稀释剂中的推荐稀释度使用一抗。确认最终体积与下表所列相符。

购买一抗时，请确保您的一抗已经过验证，可用于福尔马林固定、石蜡包埋的组织。您可以在 www.cellsignal.com 上查看经过 IHC-P 验证的抗体的综合目录。

如果使用多种一抗和二抗：结合来自独特来源物种的所有一抗（例如，兔单抗、小鼠单抗和大鼠单抗）。请勿混合来自同一来源物种的一抗。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

如果使用多种一抗和二抗：混合所有用于检测独特来源物种（例如，抗兔、抗小鼠和抗大鼠）的二抗和互补寡核苷酸。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

如果使用多种一抗和二抗：将所有涉及来源物种的封闭用同型对照抗体（例如，兔单抗、小鼠单抗和大鼠单抗）混合配置。

一旦配制，SignalStar 第 1 轮成像液应包含随试剂盒（包括用于第 1 轮成像和第 2 轮成像的抗体）订购的所有抗体（最多 7 种）以及用于第 1 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。请勿将第 1 轮成像和第 2 轮成像中的互补性寡核苷酸合并。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

SIGNALSTAR 放大缓冲液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

SIGNALSTAR 放大缓冲液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。在制作溶液之前，请完整阅读第 5 节的 SignalStar 第 1 轮成像：使用的实验步骤。

可以在您开始实验前当天焙烘载玻片。此步骤可使固体石蜡融化并使组织更好地粘附在载玻片上。

1. 将载玻片在 60°C 孵育至少 30 分钟。

一旦载玻片脱蜡，任何时候切勿让它们干透。加湿箱用于所有孵育步骤。确保每种溶液覆盖整个组织。

2. 在二甲苯洗液中孵育切片 3 次，每次 5 分钟。

3. 在 100% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

4. 在 95% 乙醇洗液中孵育切片 2 次，每次 10 分钟。

5. 在 dH₂O 中洗涤切片 2 次，每次 5 分钟。

建议在加压蒸煮器中进行 EDTA 抗原修复，以最大限度修复表位。本实验步骤描述了对 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 建议的条件。设备特定的设置。对于其他高压锅，应使用制造商推荐的操作说明。

7. 将 500 mL dH₂O 置入高压锅中。

8. 将载玻片架置入高压锅，接触到隔热板。用载玻片容器盖子盖住一部分。

可能好的是，将第二个以 250 mL 水和空白载玻片填充的 24 位载玻片架置入高压锅并用盖子部分盖住。

9. 密封蒸煮器室，并继续进行修复。将 Biocare Medical Decloaking Chamber #DC2012 设置为 110°C，持续 30 分钟。

10. 小心使设备通气，随后取下盖子。

11. 从去掩蔽室取出载玻片容器，允许在实验台上冷却 10 分钟。

13. 彻底甩掉载玻片上的液体，并根据制造商的方案在 150 µL 一抗溶液中孵育。

可以将载玻片在 4°C 的一抗溶液中孵育过夜，以将实验步骤分为多天。

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

15. 彻底甩干载玻片上的液体，并于室温下在 150 µL 二抗溶液中孵育 40 分钟。

16. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

17. 彻底甩干载玻片上的液体，并于室温下在 150 µL 二级封闭液中孵育 40 分钟。

18. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

19. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。

20. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

21. 将载玻片在 150 µL SignalStar 第 1 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

可以将载玻片在 4°C 下孵育过夜，以便将实验步骤拆分成多天。

22. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 1X TBST 中 30 秒。

23. 将载玻片在 10% 中性缓冲福尔马林中室温孵育 5 分钟。

24. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

1. 将载玻片在 150 µL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
3. 将载玻片在 150 µL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

26. 将载玻片在 150 µL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

27. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

28. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。

29. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

30. 用 DAPI 溶液复染。

31. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

32. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

33. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。

一旦成像完成，就可以从载玻片移除荧光信号，从而可以进行另一轮成像。在第一轮成像之后尽快进行第 2 轮成像。

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。在制作溶液之前，请完整阅读第 7 节的 SignalStar 第 2 轮成像：使用的实验步骤。

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

除非另有说明，SignalStar 试剂盒组分应在使用前立即于室温下解冻，然后在使用时存放在冰上。

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

一旦配制，SignalStar 第 2 轮成像液应仅包含用于第 2 轮成像的互补性寡核苷酸。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

不向第 2 轮成像溶液添加 SIGNALSTAR 偶联物。

请勿合并相同荧光信道的互补性寡核苷酸。请勿将第 1 轮成像和第 2 轮成像中的互补性寡核苷酸合并。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

SIGNALSTAR 抗体稀释液具有粘性。如果溶液未精确量取或充分混合，荧光信号可能变动不定或减弱。使用低吸附移液器吸头将 SignalStar 试剂盒组分混合到 15 mL 锥形管中。缓慢移液以确保准确度。在室温下颠倒转动 20 分钟。不使用时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

配制溶液时，所有 SignalStar 试剂盒组分均存放于冰上。一旦混合，SignalStar 溶液应保存在室温并立即使用。

每种溶液都应新鲜制作并及时使用。在制作溶液之前，请完整阅读第 7 节的 SignalStar 第 2 轮成像：使用的实验步骤。

SIGNALSTAR 第 2 轮成像仅为要求两个成像轮次的抗体检验组合所需。利用本文档第 9.1 节和第 8.1 节中的 SignalStar 检验组合设计示例和 SignalStar 检验组合设计工作表，获取指导和帮助。

1. 采集图像用于第 1 轮成像后，将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。

2. 将载玻片在 37°C 下于 150 µL 荧光移除液中孵育 2 小时。

3. 将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

4. 可选：

1. 将载玻片封固在含 DAPI #4083 的 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 中，并对载玻片成像以确认无荧光信号余留。
2. 将载玻片浸泡于 dH₂O 中 ≥ 30 分钟，以轻柔取下盖玻片而不损坏组织。
3. 将载玻片浸没于 dH₂O 中 30 秒。

5. 将载玻片在 150 µL SignalStar 第 2 轮成像液中室温孵育 40 分钟。

6. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

1. 将载玻片在 150 µL 放大液 1 中孵育 8 分钟。
2. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。
3. 将载玻片在 150 µL 放大液 2 中孵育 8 分钟。
4. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

8. 将载玻片在 150 µL SignalStar 连接缓冲液中室温孵育 20 分钟。

9. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

10. 根据数据表说明，配制 DAPI #4083 溶液。

11. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

12. 用 DAPI 溶液复染。

13. 将载玻片浸没于 1X TBST 中 30 秒。

14. 从载玻片彻底拂去液体，然后浸没于 dH₂O 中 30 秒。

15. 将载玻片用 ProLong Gold Antifade Reagent #9071 封固。

16. 尽快对载玻片成像。信号应保持稳定长达 8 小时。