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Simple Western 实验步骤

适用于 Jess、Abby、Leo Systems 和类似的 Simple Western 系统

Simple Western 检测是基于毛细管的免疫学检测方法，可实现传统蛋白质印迹工作流程自动化，从而省去凝胶浇注、转移和胶片曝光等手动操作步骤。 Simple Western 技术具有高灵敏度、可重现性和定量性，只需 3 μL 输入样品，即可在短至 3 小时获得完整分析结果。本实验步骤概述了使用 Simple Western 系统（包括 Jess、Abby 和 Leo 系统）进行蛋白质分析的关键步骤。Cell Signaling Technology (CST) 已对精选抗体进行严格验证，确保其适用于 Simple Western 检测。使用 CST® 抗体时，请务必参考具体 CST 产品网页或说明书中通过化学发光检测模式验证的建议稀释范围。

A. 溶液与试剂

除用户自备的一抗外，所有必要的试剂（从样品制备到信号检测）都包含在 Simple Western 分离和检测模块中。

  1. 选择适用于您的仪器、检测模式（化学发光或荧光）和靶标分子量范围的分离模块。

    1. 化学发光分离模块

    2. 荧光分离模块

  2. 选择适用于您的一抗和检测模式的检测模块。

    注：

    • 化学发光检测模块有两种规格供选，分别支持 200 根或 600 根毛细管，适用于 Jess、Abby 和 Leo 系统。
    • 荧光检测模块提供支持 200 根毛细管的规格，仅适用于 Jess 系统。
    • 对于 Leo 系统，可使用 600 根毛细管的检测模块以获得最佳通量。

    1. 化学发光检测模块

    2. 荧光检测模块

B. 样品制备

  1. 制备 400 mM DTT（透明试管）。用移液器吸头穿刺箔，加入 40 μL 去离子水，轻轻混合。
  2. 制备 5X 预混液（粉色试管）。加入 20 μL 10X 样品缓冲液和 20 μL 制备的 DTT 溶液。轻轻混合。
  3. 使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 缓冲液或其他适用的裂解缓冲液来裂解细胞。最佳蛋白浓度取决于您靶标蛋白质的表达水平。 根据需要使用 0.1X 样品缓冲液稀释裂解物。
  4. 混合四份裂解物和一份 5X 预混液。用移液器轻轻混合，然后封闭试管。
  5. 涡旋混合。在 95°C 下加热 5 分钟。涡旋并离心样品。
  6. 将制备好的样品置于冰上。

C. 抗体溶液制备

  1. 使用随检测模块提供的抗体稀释液 2 稀释您的一抗。如果使用山羊一抗，请用提供的无乳抗体稀释剂稀释。

    2. 注：对于 CST 一抗，请务必参考产品网页或 CST 网站 (cellsignal.cn) 上的说明书中通过化学发光检测模式验证的建议稀释范围。

  2. 检测模块中提供的二抗为即用型产品。
  3. 将制备好的抗体储存在冰上。
  4. 制备鲁米诺-S 和过氧化物溶液（如适用）。在微量离心管中混合 200 μL 鲁米诺-S 和 200 μL 过氧化物，用移液器混合，并储存于冰上。

D. 孔板设置

  1. 查阅针对特定检测孔板制备提供的产品说明书，完成样品板上样操作。

    2. 注：孔板上样操作兼容多种自动化移液解决方案。

  2. 以 1,000 x g（约 2,500 rpm）离心样品板 5 分钟，确保液体完全沉降至孔中。运行 Leo 系统时，离心预充试剂板。

E. 仪器操作

  1. 打开 Compass for Simple Western 软件，这是 Simple Western 仪器的控制和数据分析应用程序。
  2. 点击 New Assay（新检测）并根据您的需要选择检测类型和大小范围，或选择 Open Assay（打开检测），从已保存的检测菜单中进行选择。
  3. 分别在 Layout（布局）和 Protocol（实验步骤）窗格中分配样品板行和检测参数。运行 Leo 系统时，在Sample Layout（样品布局）中点击 Assay Setup（检测设置），指定所需的卡盒和样品板行。
  4. 从样品板（Jess 和 Abby）或预充试剂板 (Leo) 上移除防蒸发密封膜。
  5. 将准备好的样品板和毛细管卡盒装入仪器。 运行 Leo 系统时，将预充试剂板装入预充试剂板支架。关闭仪器门。
  6. 单击 Compass 中的 Start（开始）按钮。仪器将自动执行以下操作：
    1. 毛细管电泳
    2. 将蛋白质固定到毛细管壁上
    3. 封闭
    4. 一抗孵育
    5. 二抗孵育
    6. 信号检测和图像/数据采集
  7. 运行完成后，丢弃毛细管卡盒和孔板。

F. 数据分析

  • 运行完成后，Compass for Simple Western 将自动生成电泳图、泳道视图图像和数据的定量结果表。
  • 使用内置工具对数据进行标注、生成标准曲线并进行蛋白质表达的标准化分析。
  • 如需了解更多信息，请参阅 Compass for Simple Western 用户指南。

如需了解有关 Simple Western 技术的更多信息并查找相关资源，请访问：bio-techne.com/simplewestern。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。

Simple Western、Jess、Abby、Leo 和 Compass for Simple Western 是 ProteinSimple 的商标和/或注册商标。

2025 年 9 月发布

如有任何问题，请联系我们。