冷冻组织的免疫荧光实验步骤 (IF-F)

重要事项：请参阅产品网页或说明书上的产品使用信息部分，以确定您的产品是否已经过验证可用于冷冻组织切片 (IF-F)。

A. 溶液与试剂

请使用我们的 Immunofluorescence Application Solutions Kit #12727 中的预制试剂，以获得高质量的免疫荧光数据。

注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)。配制 1 L 1X PBS：添加 100 mL 10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline #12528 到 900 mL dH2O 中，混匀。将 pH 值调节至 8.0。
2. 4% Formaldehyde, Methanol-Free #47746：使用新鲜溶液。
3. 封闭液：使用即用型 Immunofluorescence Blocking Buffer #12411，或通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，Normal Goat Serum #5425）和 30 µL Triton X-100 到 9.5 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS/5% 正常血清/0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：使用即用型 Immunofluorescence Antibody Dilution Buffer #12378，或通过添加 0.1 g BSA #9998 和 30 µL Triton X-100 至 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS/1% BSA/ 0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
5. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。 单击此处获得可用于免疫荧光法的二抗列表。
6. 封片剂：使用 Prolong Gold AntiFade Reagent #9071 或 Prolong Gold AntiFade Reagent with DAPI #8961。
7. 可选溶液

重要事项：CST^® 抗体如采用的制备步骤（可选），可获得更佳结果。 请参见产品网页上的实验步骤，了解详情。
1. 1X 柠檬酸盐修复液：要制备 250 mL 1X 柠檬酸盐修复液，可用 225 mL dH₂O 来稀释 25 mL SignalStain^® Citrate Unmasking Solution (10X) #14746。
2. 100% Methanol #13604：使用前先冷却。

B. 组织制备

1. 固定：使用在 1X PBS 中稀释至 4% 的高质量甲醛进行固定，以保存组织抗原。使用新鲜的固定剂并正确丢弃未使用的固定剂。 为了获得最佳结果，请按照批准的实验步骤进行动物灌注。
   1. 对于新鲜冷冻样品，将组织切成厚度在 6-20 μm 之间的切片，粘附于带正电荷的载玻片上，随后在室温下固定 15 分钟。
2. 甲醇通透（可选）：用冰冷的 100% 甲醇覆盖组织切片，并在 –20°C 下或冰上孵育 10 分钟。切勿让切片干燥。
3. 抗原修复（可选）：将载玻片浸入 1X 柠檬酸盐修复液中，放入微波炉中加热直至沸腾，并让温度维持在大约 70°C 20 分钟。随后将载玻片放在实验台上冷却 30 分钟。

C. 免疫染色

注：切勿在此过程期间让样品干燥，并保护敏感荧光团免受光照。

1. 用 1X PBS 短暂润洗载玻片。
2. 在封闭液中封闭标本 60 分钟。
3. 封闭期间，按产品网页或数据表所示通过在抗体稀释缓冲液中稀释来制备每种一抗。
4. 吸干封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
5. 在 4°C 下过夜孵育。
6. 用 1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。

注：如使用荧光素偶联的一抗，则直接跳至第 9 步。

7. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1-2 小时。
8. 在 1X PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
9. 进行适当的复染，然后封片进行样品成像。

如有任何问题，请联系我们。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。