基于细胞成像的免疫荧光实验步骤（免疫细胞化学）

重要事项：请参阅产品网页或说明书上的产品使用信息部分，以确定您的产品是否已经过相应验证可用于细胞系 (IF-IC)。

A. 溶液与试剂

请使用我们 Immunofluorescence Application Solutions Kit #12727 中的预制试剂，以高效获得高质量的免疫荧光图片。

注：用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

1. 1X 磷酸盐缓冲液 (PBS)。配制 1 L 1X PBS：添加 100 mL 10X Wash Buffer, Phosphate Buffered Saline #12528 到 900 mL dH₂O 中，混匀。 将 pH 值调节至 8.0。
2. 其他试剂
   1. 4% Formaldehyde, Methanol-Free #47746：使用新鲜溶液。
   2. 100% Methanol #13604：使用前先冷却。
3. 封闭液：使用即用型 Immunofluorescence Blocking Buffer #12411，或通过添加 0.5 mL 与二抗同一物种来源的正常血清（例如，Normal Goat Serum #5425）和 30 µL Triton X-100 到 9.5 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS/5% 正常血清/0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
4. 抗体稀释缓冲液：使用即用型 Immunofluorescence Antibody Dilution Buffer #12378，或通过添加 0.1 g BSA #9998 和 30 µL Triton X-100 至 10 mL 1X PBS 中来制备 1X PBS/1% BSA/ 0.3% Triton X-100 缓冲液。4°C 保存。
5. 荧光素偶联的二抗：使用对您的一抗宿主物种（例如兔子）具有反应性的二抗。 单击此处获得可用于免疫荧光法的二抗列表。
6. 封片剂：使用 Prolong Gold AntiFade Reagent #9071 或 Prolong Gold AntiFade Reagent with DAPI #8961。

B. 样品制备

重要事项：CST^® 抗体如采用特定样品制备步骤，可获得更佳结果。请参见产品网页上的实验步骤，了解详情。

• 固定
  • 甲醛固定：用 4% 甲醛在室温下固定细胞 15 分钟。
  • 甲醇固定：轻轻滴加冰冷的 100% 甲醇，使其覆盖细胞，然后在 –20°C 下或冰上孵育 15 分钟。请勿让样品干燥。
• 洗涤。吸干固定剂，然后在 1X PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
• 通透（甲醛固定后）
  • Triton X-100 通透：转至第 C 节，步骤 1。
  • 甲醇通透：用冰冷的 100% 甲醇覆盖细胞，然后在 –20°C 下或冰上孵育 10 分钟。吸干甲醇，然后在 1X PBS 中洗涤三次，每次 5 分钟。请勿让样品干燥。

C. 免疫染色

1. 在封闭液中封闭标本 60 分钟。
2. 封闭期间，按产品网页或说明书所示通过在抗体稀释缓冲液中稀释来制备每种一抗。
3. 吸干封闭溶液，然后加入稀释后的一抗。
4. 在 4°C 下过夜孵育。
5. 用 1X PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。

注：如使用荧光素偶联的一抗，则直接跳至第 8 步。

6. 用抗体稀释缓冲液将荧光素偶联的二抗稀释后，避光孵育标本 1-2 小时。
7. 在 1X PBS 中洗涤 3 次，每次 5 分钟。
8. 进行适当的复染，然后封片进行样品成像。
9. 如需长期保存，请在 4°C 下避光保存样品。

如有任何问题，请联系我们。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。