PathScan® 夹心 ELISA 实验步骤（快速实验步骤）

注：此实验步骤适用于使用直接与 HRP 偶联的检测抗体的 PathScan^® 试剂盒（快速实验步骤），而不用于依次添加检测用抗体和HRP 二抗的两步法。

注：用去离子水/纯净水或等效水制备溶液。

微孔测试条：开封/使用前请将所有微孔条板恢复至室温。应将未使用的微孔板条放回可重复密封且含有干燥剂包的原装袋中并存储于 4°C 下。
检测抗体：用 1 mL HRP 稀释剂（红色溶液）配制冻干检测抗体（红色块状物），以获得浓缩的原液。在室温下孵育 5 分钟，同时不时轻轻混合，以充分复溶。如需配制最终使用溶液，则在一根干净试管中添加满 1 mL 配制的检测抗体到 4.5 mL HRP 稀释剂中，轻轻混合。为获得最佳结果，请在配制抗体后立即使用。未使用的经配制的检测抗体可在 4°C 下保存长达 4 周，尽管与最新配制的抗体相比可能会存在一些信号降低。
HRP 稀释剂：红色稀释剂用于配制和稀释与 HRP 相关的检测抗体。
1x ELISA 洗涤缓冲液：通过用去离子水稀释 ELISA Wash Buffer (20X)（每个试剂盒中均有提供）至 1X 来制备。
1X 细胞裂解缓冲液：通过用去离子水稀释 10X Cell Lysis Buffer #9803 至 1X 来制备。这种缓冲液可在 4°C 下存放供短期使用（1-2 周）。建议：用于制备细胞裂解物时，在使用前再添加 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail（#5872，未提供）和 1 mM phenylmethyl- sulfonyl fluoride（PMSF，#8553，未提供）。
TMB Substrate (#7004)：使用前请恢复至室温。
STOP Solution (#7002)：使用前请恢复至室温。

针对粘附细胞。

当培养物达到 80–90% 汇合度时，吸出培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞进行所需时间的处理。
移除培养基并将细胞用冰冷的 1X PBS 润洗一次。
去除 PBS，每块平板（直径 10 cm）添加 0.5 mL 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail），平板放在冰上孵育 5 分钟。
从平板刮下细胞并转移至适当的试管。置于冰上。
在冰上超声处理裂解物。
在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。按单次样品量分装保存在 -80°C 下。

对于悬浮细胞

当培养物达到 0.5–1.0 x 10⁶ 个活细胞/mL 时，通过低速离心（约 1200 rpm）去除培养基。添加含有调节因子的新鲜培养基，对细胞进行所需时间的处理。
通过低速离心分离（约 1200 rpm）采集细胞，并用 5-10 mL 冰冷的 1X PBS 洗涤一次。
从 50 mL 生长培养基中收获的细胞可在 2.0 mL 1X 细胞裂解缓冲液（含 1 mM PMSF 和 Protease/Phosphatase Inhibitor Cocktail）中进行裂解。
在冰上超声处理裂解物。
在 4°C 用微量离心机离心 10 分钟 (14,000 rpm)，并将上清液转移至一支新试管。上清液即为细胞裂解物。按单次样品量分装保存在 -80°C 下。

注：在检测之前，请将所有材料和已制备的试剂平衡至室温。

如上（第 A 部分）所述制备所有试剂。
样品应不作稀释或用 1X 细胞裂解缓冲液稀释至 2X 蛋白浓度，以便在添加检测抗体后达到最终的 1X 蛋白浓度。每个试剂盒的独立数据表都提供一条敏感度曲线，可在选择合适的起始裂解物浓度时作为参考。这条敏感度曲线显示了一个范围内裂解物浓度点的典型结果。
向对应的孔添加 50 μL 每种样品。
向每个孔中添加 50 µL 检测抗体。
对平板进行密封，并在室温下于设定为 400 rpm（中度振荡）的平板摇床上孵育 1 小时。
轻轻取下胶带并洗涤各孔：

向每个孔添加 100 µL TMB Substrate。用胶带密封并在平板摇床（400 rpm，中度振荡）上于室温下黑暗环境中将平板孵育 15 分钟，或者在不振荡的情况下于 37°C 下孵育 10 分钟。
向每个孔添加 100 µL STOP Solution。温和振摇数秒。

注：阳性反应的初始颜色为蓝色，一旦添加 STOP Solution，就变为黄色。

2020 年 7 月创建