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  4. Multiplex Oligos for Illumina Protocol (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)

Multiplex Oligos for Illumina Protocol (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN)

下一代测序分析 (NG-seq) 是一种可以在染色质免疫沉淀 (ChIP) 及核酸酶靶向切割和释放 (CUT&RUN) 测定法下游用来跨整个基因组鉴定并定量靶标 DNA 富集情况的高通量方法。Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 含有适配体和引物，非常适合用于制备复用样本，以在 Illumina Systems 平台 (Illumina, Inc.) 上进行 NG-seq。这种试剂盒可以用于生成可并入单个测序反应中多达 12 个不同的条形码化 ChIP-seq 或 CUT&RUN DNA 文库。

每一个试剂盒组分均进行严格的质控，并且对于每一个新批次，都在 Illumina Systems 测序平台上通过构建和测序带有索引的文库来对整套试剂进行功能性验证。

本产品提供足以制备多达 24 个 DNA 测序文库的试剂，并且必须与 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 联合使用。

兼容性检测试剂盒：

SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
CUT&RUN Assay Kit #86652

不兼容的 SimpleChIP® 试剂盒：

SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
注：琼脂糖微珠被超声处理的鲑鱼精子 DNA 封闭，这将污染 DNA 库制备和 NG-seq。

所需的试剂：
包括的试剂：

  1. • （红色）Adaptor for Illumina Systems #42436
  2. •（红色）USER Enzyme #59713
  3. •（蓝色）Universal PCR Primer for Illumina Systems #12078
  4. •（蓝色）Index 1 Primer for Illumina® #28248
  5. •（蓝色）Index 2 Primer for Illumina Systems #41836
  6. •（蓝色）Index 3 Primer for Illumina Systems #64036
  7. •（蓝色）Index 4 Primer for Illumina Systems #83765
  8. •（蓝色）Index 5 Primer for Illumina Systems #18392
  9. •（蓝色）Index 6 Primer for Illumina Systems #27180
  10. •（蓝色）Index 7 Primer for Illumina Systems #43985
  11. •（蓝色）Index 8 Primer for Illumina Systems #68962
  12. •（蓝色）Index 9 Primer for Illumina Systems #83219
  13. •（蓝色）Index 10 Primer for Illumina Systems #90275
  14. •（蓝色）Index 11 Primer for Illumina Systems #28019
  15. •（蓝色）Index 12 Primer for Illumina Systems #39090

未包括的试剂：

  1. 适合用于制备 ChIP 或 CUT&RUN Illumina Systems NG-seq 文库的酶和缓冲液：在 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中提供
  2. Nuclease-free Water #12931
  3. AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
  4. 新鲜制备的 80% 乙醇
  5. 1X TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)
  6. 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
  7. Magnetic Separation Rack #7017/#14654
  8. Agilent Bioanalyzer Systems and Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, Inc.)
  9. PCR 试管和 PCR 仪器

一、简单的合并指南：

Illumina Systems NG-seq 平台使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。如果未保持色彩平衡，则该索引读数测序可能会无效。请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：

Index 7 Primers for Illumina Systems Index 5 Primers for Illumina Systems
Index 1 Primer for Illumina Systems

ATCACG

 Index 1 Primer for Illumina Systems

ATCACG
Index 2 Primer for Illumina Systems

CGATGT

 Index 2 Primer for Illumina Systems

CGATGT
Index 4 Primer for Illumina Systems

TGACCA

 Index 3 Primer for Illumina Systems

TTAGGC
Index 7 Primer for Illumina Systems

CAGATC

 Index 4 Primer for Illumina Systems

TGACCA

✔✔✔✔✔✔
✔✘✘✔✔✔

以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：

2 样品池 Index 6 和 12 引物
3 样品池 Index 4、6 和 12 引物
6 样品池 Index 2、4、5、6、7 和 12 引物

如果每个索引引物随 Universal PCR Primer for Illumina Systems 仅使用一次，则 Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) (ChIP-seq, CUT&RUN) 可生成 12 份不同的条形码化样品。每个索引引物的量足以用于生成两个库，但这两个库无法合并到一个测序泳道中。

对于 1-plex（无混池），任意索引引物均可与通用 PCR 引物共同使用。


二、Index 1-12 Primers for Illumina Systems：

每份 Index Primer for Illumina Systems 的体积为 10 µl。

Index 1 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

ATCACG
Index 2 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

CGATGT
Index 3 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGA-
GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

TTAGGC
Index 4 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGA-
GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

TGACCA
Index 5 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGA-
GTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

ACAGTG
Index 6 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

GCCAAT
Index 7 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

CAGATC
Index 8 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

ACTTGA
Index 9 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

GATCAG
Index 10 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

TAGCTT
Index 11 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGA-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

GGCTAC
Index 12 Primer for Illumina Systems 5´-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAG-
TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC-s-T-3´

CTTGTA

其中 -s- 表示硫代磷酸键。


三、设置 PCR 反应

  1. 确保是否使用了有效的索引引物组合。请参见第一和第二部分，验证是否选择了正确的引物组合。
  2. 每根 PCR 试管仅添加一份索引引物 (•) (5 µl) 和 5 µl 通用 PCR 引物 (•)。更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
  3. 记录添加到每根 PCR 试管的索引引物。
  4. 向含有引物的每根试管添加 25 µl Q5 PCR Master Mix (•)。
  5. 往相应试管添加 15 µl 接头连接的 ChIP DNA，直至最终容量为 50 µl。轻轻上下吹打 5–10 次以混匀。更换样品之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
  6. 记录添加到每根 PCR 试管的接头连接的 DNA 样品。
  7. 根据推荐的循环条件快速离心并执行 PCR（请参阅 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 中用于 ChIP-DNA 起始样品或 CUT&RUN DNA 起始样品的相应实验步骤）。

附录：试剂盒组分的质量控制

SimpleChIP® ChIP-seq Multiplex Oligos for Illumina Systems (Single Index Primers) #29580 中的组分在下文所列的功能检测中进行了单独验证，且必须通过严格的质量控制标准。此外，每组组分都通过在 Illumina Systems 测序平台上构建和测序有索引的库来进行功能性验证。

一、Adaptor for Illumina Systems (15 μM) (•)

5´´-/5Phos/GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C/ideoxyU/A CAC TCT TTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT C-s-T-3´´

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在50 μl 反应体积中加入这种接头和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1X 反应缓冲液和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 这种接头和 1 μg φX174 RF 1 DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率 < 10%。
  3. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺@ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中最低 10 μl 的这种接头在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。
  4. 核糖核酸酶活性：将这种接头和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。

二、USER Enyzme (•)

存放在 50 mM KCl、5 mM NaCl、10 mM Tris-HCl (pH 7.4 @ 25°C)、0.1 mM EDTA、1 mM DTT、175 μg/ml BSA 和 50% 甘油中

质量控制检测

  1. 非特异性 DNase 活性（16 小时）：在 50 μl 反应体积中加入 1 μg λ DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μg λ HindIII DNA 和至少 25 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 DNA 模式没有可检测的核酸酶降解。
  2. 核酸外切酶活性（放射活性释放）：在 50 μl 反应体积中加入 1 μg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 NEBuffer 1 孵育 4 小时，释放 < 0.1% 的总放射活性。在 50 μl 反应体积中加入 1 μg 单双链 [3H] 大肠杆菌 DNA 混合物和至少 10 个单位的 Endonuclease VIII，并在 37°C 下用 Endonuclease VIII Reaction Buffer 孵育 4 小时，释放 < 0.5% 的总放射活性。
  3. 核酸内切酶活性（带切口）：在 50 μl 反应体积中加入 1 μg 超螺旋 φX174 DNA 和至少 50 个单位的尿嘧啶 DNA 糖基化酶，并在 37°C 下用 UDG Reaction Buffer 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳测定带切口形式的转化率 < 10%。
  4. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺@ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中最低 10 μl 1X 浓度 USER Enzyme 在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。

三、Universal PCR Primer for Illumina Systems (10 μM) (•)

5´´-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC*T-3´´

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入这种引物和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 1 μl 引物 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也无可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：在 50 μl 反应体积中加入至少 5 μl 引物和 1 μg φX174 RF I DNA，并在 37°C 下用检测缓冲液孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定 RF II 的转化率 < 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：将 1 μl 引物和 40 ng FAM 标记的 RNA 转录物在 37°C 下孵育 16 小时，经聚丙烯酰胺凝胶电泳确定没有可检测的核糖核酸酶活性。
  4. 磷酸酶活性：将含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺@ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中最低 10 μl 的这种引物在 37°C 孵育 4 小时，经分光光度计分析确定在 405 nm 处没有对硝基苯阴离子。

四、Index 1-12 Primers for Illumina Systems (10 μM) (•)

质量控制检测

  1. 16 小时的孵育：在 50 μl 反应体积中加入 1 μl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 μg HindIII 酶切 λ DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定没有可检测的非特异性核酸酶降解。在 50 μl 反应体积中加入 Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 μg T3 DNA，并在 37°C 下孵育 16 小时，经琼脂糖凝胶电泳确定也没有可检测的非特异性核酸酶降解。
  2. 核酸内切酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 μl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 1 μg φX174 RF I 超螺旋化 DNA 的 50 μl 反应在 37°C 孵育 4 小时，经琼脂糖凝胶电泳导致向 RF II（带切口的分子）转化低于 10%。
  3. 核糖核酸酶活性：如通过琼脂糖凝胶电泳确定，含 1 μl Index [X] Primer for Illumina Systems 和 40 ng RNA 转录物的 10 μl 反应在 37°C 孵育 16 小时未产生可检出的 RNA 降解。
  4. 磷酸酶活性：如通过 405 nm 处分光光度分析确定，在 37°C 于含 2.5 mM 对硝基苯磷酸酯的蛋白磷酸酶分析缓冲液（1 M 二乙醇胺 @ pH 9.8 和 0.5 mM MgCl2）中孵育 Index [X] Primer for Illumina Systems 4 小时未产生可检出的对硝基苯阴离子。

2017 年 11 月发布

2023 年 1 月修订

实验步骤编号：1626