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InTraSeq™ 3' 实验步骤

InTraSeq™ 3' 实验步骤

为获得最佳效果：

保持无 RNase 且无菌的工作空间。
强烈建议使用带有过滤器的移液器尖端。
在开始 B. 封闭（第 2 天）直至实验步骤结束时，以 850 x g（非 RPM）进行离心至关重要。
在开始 C. 免疫染色（第 2 天）时，在去除和丢弃上清液时，保持细胞沉淀物浸没在液体中（约 40 µL）至关重要。
在任何步骤中丢弃上清液时请勿使用真空抽吸；务必使用移液器。
确保试剂在使用前完全解冻。

注意：

CST 在采用特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 中验证了所有 InTraSeq™ 3' 的检测试剂盒组分。
安全停止 - 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。
该实验步骤专为单个 InTraSeq™ 检测（一个样品）而设计。如果处理多个样品，则应按比例调整所有数量。

溶液和试剂

试剂盒中包含的材料（储存在 -20°C 下）

InTraSeq™ Blocking Buffer A #10471
InTraSeq™ Blocking Buffer B #31701
InTraSeq™ Staining Buffer #46005
InTraSeq™ Wash Buffer #59335
InTraSeq™ Reducing Agent #63760
InTraSeq™ RNase Inhibitor #79298
Rabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000) #81472
Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) #68984

下列所需试剂未包含在内

InTraSeq™ 3' 偶联物/抗体混合物
两个无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器
涡旋混合器
1.5 mL 无菌聚丙烯微量离心管 - LoBind
15 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（首选 LoBind）
50 mL 锥形无菌聚丙烯离心管（首选 LoBind）
Phosphate Buffered Saline (PBS-1X) pH7.2 (Sterile) #9872
Methanol #13604
Human Fc Receptor Blocking Solution #58948（如果使用 G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470）
Antibody Dilution Buffer #13616（如果使用 G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470）

开始之前：

（可选）收到试剂盒后，请解冻并用移液器混合 InTraSeq™ 封闭液 A，然后将 875 µL 分装到 8 个单独的 1.5 mL 无菌微量离心管中。

A. 细胞固定（第 1 天）

计数 100 万到 500 万个细胞并将其转移到一支 15 mL 管中；或者，如果使用 G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470 执行免疫染色步骤，则计数并转移至少 200 万到 500 万个细胞。
注：如果细胞数量少于 100 万个，请勿继续执行该实验步骤。
将细胞在 4°C 下以 300 x g 的离心力离心 5 分钟。
取出并丢弃上清液，然后用 10 mL 冰冷的 1X PBS 洗涤细胞。
将细胞在 4°C 下以 300 x g 的离心力离心 5 分钟。
继续进行步骤 9；如果使用 G4S Linker (E7O2V) Rabbit mAb (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470 执行免疫染色步骤，则继续进行步骤 6。
在室温下使用 Human Fc Receptor Blocking Solution #58948 处理 200 万到 500 万个细胞 10 分钟，其中每 100 万个细胞加 2.5 µg 该封闭液，溶于约 100 µL Antibody Dilution Buffer #13616（或含 0.5% 牛血清白蛋白的 1X 磷酸盐缓冲盐水溶液）。
添加 3 µL G4S Linker (E7O2V) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3118) #38470 ，于 4°C 下孵育 30 分钟。
向细胞中加入 2 mL Antibody Dilution Buffer #13616（或含 0.5% 牛血清白蛋白的 1X 磷酸盐缓冲盐水溶液）。用移液器混合以重悬细胞。
在 4°C 下以 300 x g 离心 5 分钟，然后取出并丢弃上清液，操作过程中不要扰动细胞沉淀物。
重复步骤 8 和 9 两次，共洗涤 3 次。
将细胞重悬于 0.5 mL 冰冷的 1X PBS 中。
打开涡旋混合器，以低速（转速约调至 1-4 挡，取决于混合器）将其保持在“开启”状态（而非“自动/触摸”模式）。 样品不得进行涡旋处理，而是应持续混合。如果混合器转速快至会使样品涡旋，则相应降低速度。
注：在下述步骤 13 中，缓慢（>30 秒）滴落冰冷的甲醇非常重要。
确保涡旋混合器调至“开启”状态，将 15 mL 管置于涡旋混合器上，然后逐滴（>30 秒）缓慢添加 4.5 mL 的冰冷甲醇。
在 -20°C 冰箱中孵育细胞过夜。（安全停止 - 样品可在 -20°C 冰箱中储存最长 7 天，或在 -80°C 下储存最长 14 天）

B. 封闭（第 2 天）

从这时起，在每个离心步骤中，以 850 x g 的离心力对细胞进行离心至关重要。降低离心速度将导致细胞损失。

在室温下解冻以下试剂：
- 解冻 1 瓶 InTraSeq™ Wash Buffer。
- 解冻 InTraSeq™ Blocking Buffer B。
- 解冻并用移液器混合 InTraSeq™ Blocking Buffer A。
- 解冻并用移液器混合 InTraSeq™ Staining Buffer。
- 解冻并涡旋混合 InTraSeq™ Reducing Agent，直至沉淀消失。
解冻后，将试剂放在冰上。
准备加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B：
1. 将 130 µL InTraSeq™ Blocking Buffer B 分装到无菌 1.5 mL 微量离心管中。将库存 InTraSeq™ Blocking Buffer B 放回 -20°C 冰箱。
2. 将等分试管在 95°C 下加热 5 分钟。
3. 短暂离心试管，然后将其放在冰上。在以下步骤中使用这份加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B。

制备 scBlock（见下表），用移液器混合。存放在冰上。

scBlock	体积
InTraSeq™ Blocking Buffer A	860 µL
加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B	98 µL
InTraSeq™ Reducing Agent	40 µL
InTraSeq™ RNase Inhibitor	2 µL
总体积	1,000 µL

将细胞在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心 5 分钟。
取出并丢弃上清液，然后将 scBlock 添加到细胞中。用移液器混合以重新悬浮细胞，然后将细胞放在冰上至少 30 分钟。

在 scBlock 孵育期间，按如下方式制备抗体预混液：

根据所使用的 InTraSeq™ 3' 抗体混合物和单个 InTraSeq™ 3' 偶联物（Ind. InTraSeq™ 3' Conj. 或 Ind. Conj.）的数量确定抗体的体积 (Vol. of Abs.) （参见下表）。将总体积限制为 30 µL。

	体积（仅限 Cocktails）	体积（仅限 Ind. Conj.）	体积 (Cocktails + Ind. Conj.)
InTraSeq™ 3' Cocktail	5 µL（每种混合物）	N/A	___ µL（每种混合物 5 µL）
Ind. InTraSeq™ 3' Conj.	N/A	3 µL（每种 Ind. Conj.）	___ µL（每种 Ind. Conj. 3 µL）
抗体体积	___ µL	___ µL	___ µL

使用上面计算的抗体体积（最多 30 µL）制备抗体预混液（见下表）。轻轻移液混合以尽量减少气泡形成，然后储存在冰上。

抗体预混液	体积（仅限 Cocktails）	体积（仅限 Ind. Conj.）	体积 (Cocktails + Ind. Conj.)
抗体体积	___ µL	___ µL	___ µL
InTraSeq™ Wash Buffer	30 µL - 抗体体积（见上一行）
InTraSeq™ Staining Buffer	55 µL	55 µL	55 µL
加热/冷却的 InTraSeq™ Blocking Buffer B	10 µL	10 µL	10 µL
Rabbit (DA1E) Monoclonal Antibody IgG Isotype Control (InTraSeq™ 3' Conjugate 3000)	3 µL	3 µL	3 µL
Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate 3002) 或任何其他 Histone H3 (D1H2) Rabbit Monoclonal Antibody (InTraSeq™ 3' Conjugate)	3 µL	3 µL	3 µL
InTraSeq™ RNase Inhibitor	2 µL	2 µL	2 µL
总体积	103 µL	103 µL	103 µL

注：如果使用 Histone H3 (D1H2) InTraSeq 3' Conjugates 对多个 InTraSeq 样品进行多重检测，则需在对每份样品进行细胞计数和分装等量细胞后再开始步骤 8。

经过 30 分钟 scBlock 孵育时间后，将 2 mL InTraSeq™ Wash Buffer 添加到细胞中并用移液器混合。
将细胞通过无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器过滤到 50 mL 管中。
注：为了最大限度地提高细胞回收率，在过滤时对移液管的尖端施加轻微的压力。（参见图片）
将流过/过滤的细胞转移到新的 15 mL 管中并立即开始 C：免疫染色（第 2 天）。
注：将剩余的 InTraSeq™ Wash Buffer 储存在 4°C 下，以供第 3 天使用。

C. 免疫染色（第 2 天）

从此时起，每次去除并丢弃上清液时，保持细胞沉淀物浸没在液体中（约 40 µL）至关重要。细胞干燥会对 RNA 信号产生负面影响并导致细胞损失。

开始之前：

将细胞在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心 5 分钟。
取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL。
向细胞中加入 100 µL 抗体预混液。用移液器混合以重悬细胞。
转移至无菌 1.5 mL LoBind 微量离心管中，并在 4°C 下孵育过夜（约 16 小时）。
注意：
- 请勿将细胞孵育超过 20 小时。
- 在 4°C 下维持过夜孵育至关重要。

D. 洗涤和计数（第 3 天）

开始之前：

制备改良的 InTraSeq™ Wash Buffer。轻轻混合以尽量减少气泡形成，然后放在冰上。
注：如果储存瓶中还有剩余的 InTraSeq™ Wash Buffer，请将其储存在 -20°C 下。

将 1 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer 加入含有细胞的 1.5 mL 微量离心管中。用移液器混合，然后将混合物转移到 15 mL 管中。
添加 2 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer，使总体积为 3 mL。
在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心 5 分钟。取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL 。
加入 1 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer。用移液管混合以重悬细胞，然后加入另一 3 mL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer，使总体积为 4 mL。
重复步骤 3 和 4，然后通过无菌 40 微米 Falcon 细胞过滤器将 4 mL 细胞悬液过滤到 50 mL 管中。将流经/过滤后的细胞转移到新的 15 mL 试管中。
注：为了最大限度地提高细胞回收率，在过滤时对移液管的尖端施加轻微的压力。（参见图片）
在 4°C 下以 850 x g 的离心力离心细胞 5 分钟。取出并丢弃上清液，同时在管中保留约 40 µL。
向细胞中加入 100 µL 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer。用移液管混合以重悬细胞，然后将细胞置于冰上。
注：从此时起，将细胞保存在 改良的 InTraSeq™ Wash Buffer 中，包括任何必要的稀释。使用任何其他缓冲液或溶液都会导致 RNA 降解。
对细胞进行计数。请参阅采用特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 实验步骤中的细胞悬浮体积计算器表，确定所需的细胞浓度。
重要事项：仅使用改良的 InTraSeq™ Wash Buffer 稀释细胞，以达到所需的细胞浓度。

注：如果计数后观察到细胞团块，建议在进行单细胞实验之前使用移液器进行额外的混合。
使用采用特征条形码技术的 10x Genomics Chromium Single Cell 3' Kits 处理细胞。

仅供研究使用。不得用于诊断流程。