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MNase 对 CUT&RUN input DNA 的消化

输入 DNA 的片段化是与下游 NG 测序兼容所必需的，但对于下游 qPCR 分析则不是必需的。如果没有超声波仪，我们建议使用未片段化的输入 DNA 进行 qPCR 分析；然而，输入 DNA 应使用苯酚/氯仿提取和乙醇沉淀进行纯化，因为未片段化输入 DNA 的尺寸太大而无法使用 DNA 离心柱进行纯化。如果没有超声波仪并且需要进行下游 NG 测序分析，则可以使用 CUT&RUN 正常 IgG 抗体样品作为阴性对照，尽管这并不理想，因为正常的富含 IgG 的样品可能会显示非特异性 DNA 富集。或者，使用 MNase 的输入 DNA 片段化实验步骤如下所示。

注：CUT&RUN 输入 DNA 消化需要以下试剂，我们的 CUT&RUN Assay Kit #86652 中不包含以下试剂：SimpleChIP® Enzymatic Cell Lysis Buffers A & B #14282、Micrococcal Nuclease #10011、DTT (Dithiothreitol) #7016、0.5 M EDTA #7011、10% SDS Solution #20533、DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN) #14209，以及 Nuclease-free Water #12931。如果不使用我们的 CUT&RUN Assay Kit #86652，请另外购买以下试剂：Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer #93569、Protease Inhibitor Cocktail (200X) #7012、Proteinase K (20 mg/ml) #10012，以及 RNAse A (10 mg/ml) #7013。

开始之前：

! 所有缓冲液体积应根据输入 DNA 样品的数量成比例增加。

  • 将 Concanavalin A Bead Activation Buffer 放在冰上。
  • 取出并加温 200X Protease Inhibitor Cocktail (PIC) #7012。使用前确保它完全融化。
  • 制备 1 M DTT (192.8 mg DTT #7016 + 1.12ml dH2O)。确保 DTT 晶体完全溶解。

    (!!) 重要事项：一旦配制在溶液中，将 1 M DTT 置于 -20°C 下存放。

  • 对于每份输入样品，制备 1 ml 1X Buffer A (250 µl 4X Buffer A #7006 + 750 µl Nuclease-free Water #12931 + 0.5 µl 1M DTT + 5 µl 200X PIC)，并放置在冰上。
  • 对于每份输入制备物，制备 1.2 ml 1X Buffer B (300 µl 4X Buffer B #7007 + 900 µl Nuclease-free Water #12931 + 0.6 µl 1M DTT)，并放置在冰上。
  1. 通过轻轻上下吹打小心地重悬 Concanavalin A 磁珠，确保不要将任何磁珠悬浮液溅出试管。将每个输入样品的 10 µl 微珠悬液转移到新的 1.5 ml 微量离心管中。

    注：避免涡旋 Concanavalin A Magnetic Bead 悬液，因为反复涡旋可能会使珠子中的 Concanavalin A 发生转移。

  2. 每 10 µl 微珠添加 100 µl Concanavalin A Bead Activation Buffer。上下吹打来轻轻混合珠子。
  3. 将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后去除液体。

    注：为了避免磁珠丢失，请使用移液枪来去除液体。请勿使用真空设备抽吸。

  4. 从磁力架上取下试管。重复步骤 2 和 3 来二次洗涤微珠。
  5. 添加一体积的 Concanavalin A Bead Activation Buffer，体积等同于初始的重悬微珠的液体体积（每份样品 10 µl），上下吹打重悬。
  6. 将 10 µl 激活的微珠悬液添加到在 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤的第一部分中制备的每个输入样品中。
  7. 在室温下旋转样品 5 分钟。

    注：Concanavalin A 磁珠可能会结块或粘附在试管壁上。摇动而不是旋转试管可能有助于缓解这个问题。上下吹打来重悬珠子。

  8. 将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖上去除细胞珠子悬液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
  9. 从支架上取下试管。对每个输入样品，在 1 ml 冰冷的 1X Buffer A + DTT + PIC 中重悬细胞珠子悬液。在冰上孵育 10 分钟。每 3 分钟倒置一次样品。
  10. 将样品以 100 x g 的速度短暂离心 2 秒，以从管盖上去除细胞珠子悬液。将试管放在磁力架上，直到溶液变澄清（30 秒至 2 分钟），然后取下试管并丢弃液体。
  11. 对每个输入样品，在 1 ml 冰冷的 1X Buffer B + DTT 中重悬细胞珠子悬液。重复步骤 10，对每个输入样品，在 100 µl 1X Buffer B +DTT 中重悬沉淀物。
  12. 通过添加 39 µl 1X Buffer B + DTT 来稀释 1 µl Micrococcal Nuclease #10011 1:40。将 0.5 µl 稀释的 Micrococcal Nuclease 添加到每个输入样品中，上下吹打混合。在 37°C 下孵育 20 分钟，频繁混合以将 DNA 消化成约 150 个碱基对的长度。

    注：不要保存剩余的稀释 Micrococcal Nuclease 以供将来实验使用。Micrococcal Nuclease 在 Buffer B + DTT 中长时间不稳定。

  13. 通过为每个输入样品添加 10 µl 0.5 M EDTA #7011 来停止消化。
  14. 加入 1 µl 10% SDS 溶液 #20533（0.1% 最终浓度）、2 µl proteinase K (20 mg/ml) #10012 以及 0.5 µl RNAse A #7013 到每个样品中。涡旋混合。
  15. 在 65°C 下孵育样品 2 小时。
  16. 孵育后，以 16,000g 的速度旋转样品 2 分钟。
  17. 将试管放在磁力架上，直到溶液变清（30 秒到 2 分钟）。
  18. 收集上清液并继续使用 CUT&RUN Assay Kit #86652 实验步骤（使用离心柱进行 DNA 纯化）的第六部分 A以纯化输入 DNA。

    注：在 DNA 离心柱纯化过程中，确保向每个输入样品添加 550 µl DNA Binding Buffer，以使每 1 体积样品具有 5 体积的 DNA Binding Buffer。

2021 年 9 月发布