用于 Illumina 系统的 CUT&Tag DNA 文库制备实验步骤
下一代测序 (NG-seq) 是一种可在靶向切割和标签化 (CUT&Tag) 测定下游用于辨识并定量靶标 DNA 遍及整个基因组富集情况的高通量方法。 CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 试剂盒非常适合多重样品制备供 Illumina 系统平台上进行 NG-seq。 这种试剂盒可以用于生成多达 96 个可合并入单个测序反应中的不同、条形码化 CUT&Tag DNA 文库。 本产品兼容于借助 CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561 生成的 CUT&Tag DNA 样品以及来自其他标签化测定（例如 ATAC-seq）的 DNA 样品。 本产品不 兼容来自 SimpleChIP® Chromatin IP Kits (#9003, #9005, #56383) 的 ChIP-DNA 或 来自 CUT&RUN Assay Kit (#86652) 的 CUT&RUN DNA。
兼容性试剂：
- CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) #79561
不兼容的检测试剂盒：
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9002
- SimpleChIP® Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9003
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Agarose Beads) #9004
- SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005
- SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP Kit #56383
- CUT&RUN Assay Kit #86652
- DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795
所需的试剂
包括的试剂：
- CUT&Tag PCR Master Mix #63228
- CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems #84876
- CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems #27488
- CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems #55058
- CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems #61793
- CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems #70447
- CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems #87803
- CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems #26897
- CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems #52106
- CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems #71100
- CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems #88112
- CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems #23497
- CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems #37884
- CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems #50105
- CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems #65909
- CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems #84796
- CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems #17160
- CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems #29209
- CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems #41919
- CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems #54212
- CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems #70020
未包括的试剂：
- AMPure XP Beads (Beckman Coulter, Inc. #A63881) 或 SPRIselect Reagent Kit (Beckman Coulter, Inc. #B23317)
- 80% 乙醇（新鲜制备）
- 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)
- 磁力架/支架
- Agilent Bioanalyzer 系统和 Agilent High Sensitivity DNA Kit (5067-4626)
- PCR 管或板和 PCR 仪
CUT&Tag Dual Index Primers 和 PCR Master Mix for Illumina Systems 实验步骤
| 安全停止 | 如果需要停止，这是实验步骤中的一个安全停止点。 |
一、简单的合并指南：
双索引引物策略利用每个引物内的两个 8 碱基索引。 Index 7 引物包含 P7 序列周围的索引，而 index 5 引物则包含 P5 序列周围的索引。 对序列待测的样品的两端添加特殊索引，即可实现双索引。 将 12 个 index 7 引物的一端与 8 个 index 5 引物的一端结合在一起，便可为多达 96 种不同样品建立特殊索引。
Illumina NG-seq 系统使用红色激光/LED 给 A/C 测序，并使用绿色激光/LED 给 G/T 测序。 对于每个周期，需要读取红色和绿色通道，以确保获得正确的图像配准（即 A 或 C 必须存在于每个周期中，且 G 或 T 也必须存在于每个周期中）。 如果未保持色彩平衡，则该索引片段测序可能会无效。 请检查每个要使用的索引的序列，以确保每个周期的红色和绿色通道中都有信号。请参见以下示例：
| GOOD | |||
|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | ||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 503 |
CCTATCCT |
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 505 |
AGGCGAAG |
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 506 |
TAATCTTA |
| ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ||
| BAD | ||||
|---|---|---|---|---|
| CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems | |||
| Index 701 |
ATTACTCG |
Index 502 |
ATAGAGGC |
|
| Index 702 |
TCCGGAGA |
Index 504 |
GGCTCTGA |
|
| Index 703 |
CGCTCATT |
Index 506 |
TAATCTTA |
|
| Index 704 |
GAGATTCC |
Index 508 |
GTACTGAC |
|
| ✔✔✔✔✔✔✔✔ | ✔✔✘✔✔✘✔✘ | |||
以下表格列出了一些（但不是全部）可一起进行测序的有效索引组合：
| Plex | CUT&Tag Index 7 primers for Illumina Systems | CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems |
| 2 | Index 701 和 Index 702 Index 703 和 Index 704 Index 705 和 Index 706 Index 707 和 Index 708 Index 709 和 Index 710 Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 3 | Index 701、Index 702 和 Index 703 Index 703、Index 704 和 Index 705 Index 705、Index 706 和 Index 707 Index 707、Index 708 和 Index 709 Index 709、Index 710 和 Index 711 |
任何 Index 5 引物 |
| 4 | Index 701、Index 702、Index 703 和 Index 704 Index 703、Index 704、Index 705 和 Index 706 Index 705、Index 706、Index 707 和 Index 708 Index 707、Index 708、Index 709 和 Index 710 Index 709、Index 710、Index 711 和 Index 712 |
任何 Index 5 引物 |
| 5-12 | 任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合（根据需要） | 任何 Index 5 引物 |
| > 12 |
任何有效的 Index 7 4-plex 与任何其他 i7 引物的组合（根据需要） | Index 501、Index 502 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） Index 503、Index 504 和任何 其他 Index 5 引物（根据需要） Index 505、Index 506 和任何其他 Index 5 引物（根据 需要） Index 507、Index 508 和任何其他 Index 5 引物（根据需要） |
另一些其他有效组合如下文所列。选择一组有效的 CUT&Tag Index 7 引物和一组 有效的 CUT&Tag Index 5 引物。每个 CUT&Tag Index 7 引物和每个 CUT&Tag Index 5 引物一同使用，形成所需数量的引物对，从而为获得所需 DNA 库数而进行 PCR 扩增。
| 12 样品池 | (1) 一组 4 个 Index 7 引物 * 一组 3 个 Index 5 引物 (2) 一组 3 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 (3) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 2 个 Index 5 引物 |
| 26 样品池 | (1) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 4 个 Index 5 引物 加上任何 Index 7 引物和任何其他两个 Index 5 引物（组 4 除外） (2) 一组 6 个 Index 7 引物 * 一组 5 个 Index 5 引物 使用 30 个引物对中的 26 个来扩增 26 个文库 |
二、CUT&Tag Index 5 Primers for Illumina Systems：
每份 CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina systems 以 30 µl 量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| CUT&Tag Index 501 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA TAGCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TATAGCCT |
| CUT&Tag Index 502 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAT AGAGGCTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
ATAGAGGC |
| CUT&Tag Index 503 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACCC TATCCTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CCTATCCT |
| CUT&Tag Index 504 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGG CTCTGATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GGCTCTGA |
| CUT&Tag Index 505 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACAG GCGAAGTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
AGGCGAAG |
| CUT&Tag Index 506 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTA ATCTTATCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
TAATCTTA |
| CUT&Tag Index 507 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGGCGACCACCGAGATCTACACCA GGACGTTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
CAGGACGT |
| CUT&Tag Index 508 Primer for Illumina Systems | 5´- AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGT ACTGACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTG-s-T-3´ |
GTACTGAC |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
三、CUT&Tag Index 7 Primers for Illumina Systems：
每份 CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina systems 以 20 µl 量提供。
| 产品 | 索引引物序列 | 预期的索引引物序列读段 |
| CUT&Tag Index 701 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGT AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTACTCG |
| CUT&Tag Index 702 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTCC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGGAGA |
| CUT&Tag Index 703 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGGCATACGAGATAATGA GCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGCTCATT |
| CUT&Tag Index 704 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCGCATACGAGATGGAAT CTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAGATTCC |
| CUT&Tag Index 705 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTG AATGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
ATTCAGAA |
| CUT&Tag Index 706 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGAA TTCGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
GAATTCGT |
| CUT&Tag Index 707 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGCTT CAGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CTGAAGCT |
| CUT&Tag Index 708 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCA TTAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TAATGCGC |
| CUT&Tag Index 709 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCATAG CCGGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
CGGCTATG |
| CUT&Tag Index 710 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCGC GGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCCGCGAA |
| CUT&Tag Index 711 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGCG AGAGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
TCTCGCGC |
| CUT&Tag Index 712 Primer for Illumina Systems | 5´- CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTATC GCTGTCTCGTGGGCTCGGAGATGTG-s-T-3´ |
AGCGATAG |
其中 -s- 表示硫代磷酸键。
四、设置 PCR 反应
开始之前：
- 在室温解冻 CUT&Tag Index Primers for Illumina systems 和 CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA）。 快速离心以从管侧壁归集所有液体。
- 确保使用的 index 7 和 index 5 引物组合有效。 请参见第一和二部分，验证是否选择了正确的引物组合。
-
将以下组分添加到无菌 PCR 管或 PCR 板的单孔中。记录添加到每个 PCR 试管或孔的 CUT&Tag
Index 5 引物和 CUT&Tag Index 7 引物。
试剂 1 次 PCR 反应所需体积 (70 µl) CUT&Tag DNA（或任何标签化 DNA） 30 µl CUT&Tag PCR Master Mix 35 µl CUT&Tag Index 7 Primer for Illumina Systems (10 µM) 2.5 µl CUT&Tag Index 5 Primer for Illumina Systems (10 µM) 2.5 µl - 通过上下吹打彻底混合该反应，并快速离心以从管或板孔的侧面归集所有液体。
-
将管置于带热盖的热循环仪上，并使用以下 PCR 循环条件执行 PCR 扩增：
a. 缺口填充 58°C，5 分钟 b. 缺口填充延伸 72°C，5 分钟 c. 初始变性 98°C，30 秒 d. 变性 98°C，10 秒 e. 复性和延伸 60°C，11 秒
对于每个 CUT&Tag 反应介于 20,000 至 100,000 个之间的细胞，重复步骤 d 和 e，共 13 个循环。
对于每个 CUT&Tag 反应的 20,000 个以及以下细胞，重复步骤 d 和 e，共 14-16 个循环。
注：过多的 PCR 循环导致文库多样性较低和/或 NGS 读段重复率较高。
f. 终末延伸 72°C，1 分钟 g. 保持 4°C - 继续清除 PCR 扩增物（第五部分）。（安全停止） 或者，样品可在 -20℃ 下贮存。
注：更换试管之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。 如果从少于 30 µl 的 CUT&Tag DNA 开始，则加入无 DNA 酶水以补足使体积至 30 µl。
注：更换样品之间的末端，以免发生交叉污染，这点非常关键。
五、清除 PCR 扩增物
开始之前：
- 如果使用 AMPure XP 微珠，则在使用前将微珠升温至室温至少 30 分钟。
- 通过管倒置或上下抽吸来重悬 AMPure XP 珠或 SPRIselect 珠。
- 制备每份样品需 400 µl 80% 乙醇。
- 制备每份样品大约需 20 μl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)。
- 向第四部分步骤 3 的 70 µl PCR 反应添加 70 µl (1.0X) 重悬的 AMPure XP 微珠或 SPRIselect 微珠。 上下吹打至少 10 次来混匀。在最后的混合过程中， 注意将所有液体排出吸头。
- 在实验台上，样品在室温下孵育至少 5 分钟。
- 将试管/平板放在相应磁力架上 5 分钟，以让微珠与上清液分离。
- 小心清除和丢弃上清液。小心去除所有液体残留物， 但勿扰动含 DNA 靶标的微珠。
- 将新鲜配制的 200 µl 80% 乙醇添加到处于磁力架中的试管/平板中。 在室温下孵育 30 秒，随后小心清除和丢弃上清液。注意 勿扰动含 DNA 靶标的微珠。
- 重复步骤 5 一次，洗涤总计两次。确保在第二次洗涤后清除所有可见的液体。
- 在将试管/平板放在磁力架上，且盖子保持打开时，让微珠风干长达 5 分钟。
- 从磁力架上取下试管/平板。每份样品添加 17 µl 10 mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5)，以洗脱磁珠上的 DNA 靶标。 上下吹打 10 次以混匀。在室温下孵育至少 2 分钟。
- 将试管/平板放在磁力架上，等待 5 分钟。将 15 µl 含有 DNA 靶标的上清液小心地转移到新试管中。（安全 停止）DNA 文库可存放在 -20°C 下直至进一步使用为止。
- 测定文库 DNA 的浓度。
- 根据制造商的说明，使用 Agilent Bioanalyzer 或 TapeSatation 系统确定 CUT&Tag DNA 文库的大小分布。
- 使用 10mM Tris-HCl (pH 8.0-8.5) 调整纯化的最终文库样品的浓度，以进行高通量测序。 请参阅 Illumina 测序手册，了解 NG-seq 所要求的最佳文库 DNA 浓度和体积。
注：请勿过度风干珠子。这可能会导致 DNA 靶标回收率较低。 在微珠看起来仍然光滑，但所有可见液体均已蒸发时，洗脱样品。 如果微珠开始皲裂，则微珠太干。
注：已扩增的 CUT&Tag DNA 文库的产量可能因所使用的 DNA 定量方法而异。 如果使用 Nanodrop 或 QIAxpert 系统，组蛋白靶标的预期读数为 10-20 ng/µl，非组蛋白靶标的预期读数为 5-12 ng/µl。 如果 Nanodrop 或 QIAxpert 系统的文库浓度低于 3 ng/µl， 请在对样品进行测序之前参阅疑难解答指南。 如果使用 Qubit 荧光定量系统或 Picogreen 测定，组蛋白靶标的预期读数为 3-10 ng/µ，非组蛋白靶标的预期读数可能低于 1 ng/µl。
注：虽然针对组蛋白修饰生成的 CUT&Tag DNA 文库通常在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时显示出较多信号，但对于非组蛋白（例如转录因子和辅助因子）生成的文库往往在使用 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统时具有非常弱的信号或甚至无可见信号，但仍然生成定位率高、可确定结合峰数目高和跨整个基因组信噪比可接受的 NGS 结果。 因此，我们建议对来自转录因子和辅助因子 CUT&Tag 反应中在 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统分析时不显示信号的 DNA 文库制备物测序。
注：通常，来自组蛋白靶标的 CUT&Tag DNA 文库的浓度高于来自非组蛋白靶标的 DNA 文库。 我们使用以下公式将文库浓度从 ng/μL 转换为 nM，然后将每个文库样品稀释至相同浓度 (nM) 旨在汇集： 浓度（nM） = 1,000,000 X 浓度 (ng/µL)/文库平均大小 (bp)/660。 对于 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统不能识别文库平均大小的 CUT&Tag 文库，我们建议使用 900 个碱基对的大小有意汇集比正常产率文库更多的低产率文库。 此外，我们还建议合并这类文库，它们将具有比 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统上显示正常大小峰的文库多 5-10 倍的平坦信号。 这确保读段数目在所有样品之间均匀分布。 通常，文库汇集浓度 2 nM DNA 足以用于 NGS 目的，但总是欢迎更高浓度。