CUT&Tag：简介
与 CUT&RUN 一样，靶向剪切及标签技术 (Cleavage∘Under∘Targets∘&∘Tagmentation, (CUT&Tag)) 是一种比 ChIP-seq 更快、更经济的替代方法。与 ChIP-seq 相比，CUT&Tag 以更少样品、简化的工作流程、较低测序成本和因背景较低所致的改进信噪比来剖析染色质。CUT&Tag 比 CUT&RUN 更快，因为大部分文库制备过程在体内进行，提供等同于 CUT&RUN 的数据并令单细胞 CUT&Tag 成为可能。
Cell Signaling Technology® CUT&Tag 试剂和试剂盒以适用于其他产品的相同严格性经过验证，以确保性能。CST 还使用这些相同的试剂验证 CUT&Tag 抗体，从而每次确保性能和可靠性。
是什么让 CUT&Tag 与众不同
CUT&Tag 和 CUT&RUN 均可用于分析天然染色质，而 ChIP 和 ChIP-seq 传统上使用交联染色质。对于 CUT&Tag 和 CUT&RUN，细胞膜都透化，所以一抗可以通过核孔进入胞核，在此与目的靶标结合。适当的 pAG 酶与抗体结合，并且激活时在抗体结合处任一侧结合 DNA。
图 1. CUT&Tag 工作流程（左侧）交付稳健的蛋白质-DNA 相互作用数据，同时减少 DNA 文库制备时间。
CUT&Tag 与 CUT&RUN 有何不同？
- CUT&Tag 在一抗孵育步骤之后利用二抗孵育步骤增强信号强度。
- CUT&Tag 在高盐条件下进行。两种方法均与组蛋白分析兼容。然而，CUT&Tag 不太兼容于转录因子和辅因子，因为高盐条件可能干扰靶标蛋白质-DNA 相互作用。对于丰度较低或弱结合的靶标尤其如此。
- CUT&RUN 使用 Ca2+ 激活的 pAG-MNase 剪切 DNA，而 CUT&Tag 使用 Mg2+ 激活的 pAG-Tn5 剪切 DNA。Tn5 带有 Illumina 接头蛋白，这些接头蛋白在剪切过程中添加到染色质中。
- CUT&Tag 在标签化后使胞膜和核膜均透化，以完全溶解 CUT&Tag DNA。这导致最终 DNA 样品中同时存在标签化 DNA 和基因组 DNA，使得 CUT&Tag DNA 不兼容 qPCR 。如果需要 qPCR，我们建议执行 CUT&RUN。
- CUT&Tag 跳过了 CUT&RUN 所需的体外接头连接步骤，允许您直接跳至 PCR 扩增 DNA 文库y用于测序，从而节省宝贵的时间。
- CUT&Tag 节省的时间是累积的，这意味着随着样本数量的增加，您会节省更多时间。
CUT&Tag 提供：
更快获得结果 | 从细胞到 DNA 文库只需 1 - 2 天。由于文库制备简化，CUT&Tag 比 CUT&RUN 获得结果速度快 25% |
样品量要求少 | 样品量比 ChIP 和 ChIP-seq 少约 40 倍1 |
低测序深度=节省测序成本 | 多亏背景低，仅需要约 200 万个高质量读段。 |
何时使用 CUT&Tag 与 CUT&RUN
当您时间和/或样品不足时，CUT&Tag 和 CUT&RUN 都可以帮助您解开蛋白质-DNA 相互作用。
使用下表找出最适合您的方法！
| CUT&Tag | CUT&RUN |
|---|---|---|
与组蛋白兼容 | ✔ | ✔ |
与转录因子兼容 | 视情况而定 | ✔ |
与辅因子兼容 | 视情况而定 | ✔ |
与 qPCR 兼容 | X | ✔ |
与 NG-seq 兼容 | ✔ | ✔ |
DNA 文库制备 | 体内 | 体外 |
细胞至文库 DNA | 1-2 天 | 2-3 天 |
低细胞 | ✔ | ✔ |
易控制的单细胞 | ✔ | X |
测序深度 | 2 M | 3-5 M |
CUT&Tag 兼容于下一代测序分析 (NGS) ，并且样品和时间有限时，CUT&Tag 理想用于研究组蛋白修饰如何调节染色质结合。当您或 CST 等商业供应商专门针对 CUT&Tag 验证所使用的抗体时，它还可用于研究转录因子。
订购 CST® CUT&Tag Assay Kit #77552 以获得您进行 CUT&Tag 实验所需的所有试剂，或者仅购买您需要的试剂。所有 CUT&Tag 试剂都严格经内部验证，以确保您每次都会获得高质量试剂。您还可以从不断扩大的经 CST CUT&Tag 验证的抗体列表中选择。
可比较的数据，更快获得结果
CUT&Tag 试剂以一半的文库制备时间给予您采用 CUT&RUN 有可能的相同高质量数据。
用 CUT&Tag 分析组蛋白修饰
在研究组蛋白修饰如 三甲基组蛋白 H3 (Lys4) 或三甲基组蛋白 H3 (Lys27) 时，用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415 或按需订购的产品生成跟 ChIP-seq 和 CUT&RUN 等同的数据。用 100,000 个起始细胞在 1-2 天内从细胞转化为文库 DNA（图 2）。
图 2. 分别使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 HCT 116 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415 制备 DNA 文库。该图显示在染色体 12 上的结合情况（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 GAPDH（下图）。
图 3. 使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 NCCIT 细胞和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb #9733 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K27me3 在染色体 10 上的富集（上图），包括 PAX2 基因（下图）。
用 CUT&Tag 分析转录因子和辅因子
在研究转录因子或辅助因子如 Nanog（图 4）、雌激素受体 α（图 5）和 JARID2（图 6）时，用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415 及经 CUT&Tag 验证的抗体生成跟 ChIP-seq 和 CUT&RUN 等同的数据。使用 100,000 个起始细胞在 1-2 天内从细胞转化为文库 DNA。
图 4. 分别使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 F9 细胞和Nanog (D2A3) XP Rabbit mAb (Mouse Specific) #8822 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415 制备 DNA 文库。该图显示结合作用遍及 X 染色体（上图），包括 Nanog 的已知靶标基因 Xist（下图）。
图 5. 分别使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 和 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 MCF7 细胞（在无酚红培养基和 5% 活性炭吸附的 FBS 中生长 4 天，然后用 β-雌二醇 (10 nM) 处理 45 分钟）和 Estrogen Receptor α (D8H8) Rabbit mAb #8644 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 或 CUT&Tag 测定。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina #47415 制备 DNA 文库。该图显示在染色体 21 上的结合情况（上图），包括雌激素受体 α 的已知靶标基因 TFF1（下图）。
图 6. 使用 CUT&Tag Assay Kit #77552、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005，以 NCCIT 细胞和 JARID2 (D6M9X) Rabbit mAb #13594 进行 CUT&Tag、CUT&RUN 和 ChIP-seq 实验。对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库；对于 ChIP-seq 和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库。上图比较了 HOXA 基因周围的富集情况，下图比较了 HOXD 基因周围的富集情况，两个基因都是 JARID2 的已知靶标基因。
用 CUT&Tag 分析组织样品
您还可以使用 CUT&Tag 分析组织样品中的组蛋白标记。如果您正在分析组织中的转录因子或辅因子，我们建议您使用 CUT&RUN Assay Kit #86652。
图 7。使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜脑组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。
图 8。使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜肝组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。
图 9。使用 SimpleChIP® Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005、CUT&RUN Assay Kit #86652 或 CUT&Tag Assay Kit #77552，以 25 mg（用于 ChIP-seq）或 1 mg（用于 CUT&RUN 和 CUT&Tag）小鼠新鲜心脏组织和 Tri-Methyl-Histone H3 (Lys4) (C42D8) Rabbit mAb #9751 进行 ChIP-seq、CUT&RUN 和 CUT&Tag 实验。对于 ChIP-seq 样品和 CUT&RUN 样品，使用 DNA Library Prep Kit for Illumina Systems (ChIP-seq, CUT&RUN) #56795 制备 DNA 文库；对于 CUT&Tag 样品，使用 CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina Systems #47415 制备 DNA 文库。该图显示 H3K4me3 在染色体 6 上的富集（上图），包括 H3K4me3 的已知靶标基因 Gapdh（下图）。
甚至 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统信号低时也成功测序
纯化的 CUT&Tag DNA 可以使用诸如 Thermo Fisher Scientific NanoDrop 或 Qubit 荧光定量系统等平台定量，然后在 NGS 之前用诸如 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统等平台进行 QC。
应注意，DNA 文库计算产率可能根据所用定量方法有所不同。请查看 CST 博客“CUT&Tag DNA 文库产率：如果您的文库产率太低以致于无法用 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统检测，怎么办”，以了解更多。
即使您在 Agilent Bioanalyzer 或 TapeStation 系统谱图中看到非常弱的峰或没有可见峰，无论使用何种 CUT&Tag 试剂，您仍然可以成功对 DNA 文库测序（图 10a），因为 CUT&Tag 基线低于 ChIP-seq 和 CUT&RUN。因此，我们建议继续测序，因为即使 Bioanalyzer 或 TapeStation 系统信号低，仍然可能获得具有高基因组信号的测序数据（图 10b）。
图 10b. 对图 12a 中用 Bioanalyzer 系统分析的 DNA 文库测序，并显示了 NGS 迹线。NGS 数据显示在染色体 8 上的等效结合情况（上图），包括 TCF4 的已知靶标基因 MYC（下图）。
或者，您可以通过使用针对 DNA 文库上已知阳性因座和阴性基因座的引物，借助 qPCR 对您的 CUT&Tag DNA 文库进行 QC，以确定 NGS 之前染色质片段的富集情况。
CUT&Tag 产品选项
CST CUT&Tag 试剂盒和自选试剂由我们实验室科学家和主题专家组成的表观遗传学应用团队做了内部验证，以确保试剂在到达您的实验室时发挥作用。在下面找到用于您工作流程的正确解决方案。
货号 | 产品 |
|---|---|
| 77552 | CUT&Tag Assay Kit |
| 79561 | CUT&Tag pAG-Tn5 (Loaded) |
| 47415 | CUT&Tag Dual Index Primers and PCR Master Mix for Illumina |
| 63228 | CUT&Tag PCR Master Mix |
| 35401 | Goat Anti-Rabbit IgG (H&L) Antibody |
| 52885 | Donkey Anti-Mouse IgG (H&L) Antibody |
| 2729 | Normal Rabbit IgG |
| 68860 | Normal Mouse IgG |
| 14209 | DNA Purification Buffers and Spin Columns (ChIP, CUT&RUN, CUT&Tag) |
| 93569 | Concanavalin A Magnetic Beads and Activation Buffer |
| 16359 | Digitonin Solution |
| 27287 | 100X Spermidine |
| 7012 | Protease Inhibitor Cocktail (200X) |
| 10012 | Proteinase K (20mg/ml) |
| 20533 | 10% SDS Solution |
| 7011 | 0.5 M EDTA，pH 8.0 |
| 31415 | 10X Wash Buffer Binding Buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) |
| 15338 | CUT&RUN Antibody Binding Buffer (CUT&RUN, CUT&Tag) |
参考文献
- Kaya-Okur HS, Wu SJ, Codomo CA, et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 2019;10(1):1930. Published 2019 Apr 29. doi:10.1038/s41467-019-09982-5
CST、Cell Signaling Technology、XP 和 SimpleChIP 是 Cell Signaling Technology, Inc. 的商标或注册商标。所有其他商标均为其各自所有者的财产。访问 cellsignal.com/trademarks 以了解更多信息。
CUT&Tag 依照来自 Active Motif, Inc.的许可证、依照美国专利第 10,689,643 号和第 9,938,524 号、其外国等效专利及从中衍生的子专利提供。仅供购买者内部研究使用。不可用于转售、服务或其他商业用途。
美国专利第 11,733,248 号、外国等效专利及从中衍生的子专利。
第7,429,487号美国专利，外国对应物，以及由此而来的儿童专利。